Summary
وبعد دقيقة طريقة مبسطة لجمع وصمة عار hemocytes البعوض هو موضح. لدينا وسيلة تجمع بين بساطة نضح مع دقة عالية لتقنيات الحقن عزل الاستعدادات نظيف hemocytes الزاعجة في البعوض. هذه الطريقة تسهل الدراسات تتطلب معرفة أنواع hemocytes والوفرة.
Abstract
البعوض الناقل لعدد من العوامل الممرضة المسببة للأمراض مثل فيروس الحمى الصفراء والملاريا الطفيليات والديدان الفيلاريا. مختبرات يحققون مكافحة الممرض مكونات الجهاز المناعي في الأنواع الفطرية ناقلات الأمراض على أمل توليد البعوض المعدلة وراثيا التي يتم صهر لمسببات الأمراض مثل 1 و 2. نظام المناعة الفطري للبعوض وتتألف من عدة خطوط للدفاع 3. مسببات الأمراض التي تدير هربا من الحاجز الذي فرضته البعوض ظهارة مبطنة المعي المتوسط 4 أدخل الدملمف واللقاء hemocytes المتداولة ، والمكونات الخلوية الهامة التي تغلف ومسببات الأمراض بابتلاع 5 ، 6. الباحثين لم يجدوا دليلا على الأنسجة المكونة للدم في البعوض والأدلة الحالية تشير إلى أن يتم إصلاح عدد من hemocytes في ظهور الكبار والأرقام قد تراجع فعلا مثل البعوض الأعمار 7. القدرة على جمع بشكل صحيح وتحديد hemocytes من الحشرات الهامة طبيا هو خطوة أساسية للدراسات في المناعة الخلوية. ومع ذلك ، فإن صغر حجم البعوض ومحدودية حجم الدملمف تشكل تحديا لجمع الخلايا المناعية.
طريقتين التي أنشئت لجمع hemocytes تشمل طرد البعوض الدملمف من 8 قطع خرطوم ، والتشريد وحدة التخزين (التروية) ، حيث يتم حقن المياه المالحة في المنطقة necklike الغشائي بين الرأس والصدر (أي وعنق الرحم) ، ويتم جمع الدملمف perfused من فتح في منطقة مزقتها القاصية من البطن 9 و 10. هذه التقنيات ، مع ذلك ، هي محدودة بسبب انخفاض الانتعاش hemocytes وتلوث محتمل من قبل خلايا الجسم من الدهون ، 11 على التوالي. في الآونة الأخيرة أشارت إلى أنه أسلوب الحقن الانتعاش / استرداد عالية تحسين immunocytes باستخدام مخازن للتخثر في حين خفض مستويات تلوث الجداول والأنسجة الداخلية 11. في حين أن هذا الأسلوب يسمح للطريقة محسنة لجمع وصيانة hemocytes الأساسي للثقافة ، فإنه ينطوي على عدد من الحقن وجمع الخطوات التي ليست ضرورية إذا كان الهدف هو جمع المصب ، وإصلاح وصمة عار hemocytes للتشخيص. هنا ، علينا أن نظهر لدينا وسيلة لجمع الدملمف البعوض الذي يجمع بين البساطة في الارواء ، وذلك باستخدام مخازن للتخثر في مكان من المحلول الملحي ، مع دقة عالية لتقنيات الحقن عزل الاستعدادات نظيف hemocytes الزاعجة في البعوض.
Protocol
1. التحضير مسبقا لجمع كرية دموية
- يعد حل مخفف الدملمف التي تتكون من متوسطة شنايدر 60 ٪ ، 10 ٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، و 30 ٪ العازلة سيترات (تخثر ؛ 98 مم هيدروكسيد الصوديوم ، 186 مم كلوريد الصوديوم ، و 1.7 ملي EDTA ، 41 حمض ملي الليمون ، ودرجة الحموضة 4.5) 11. جعل aliquots 1.0 مل التي يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية. قسامة استخدام كل مرة واحدة فقط (انظر المواد).
- تحضير الشرائح الزجاجية المجهر (75 × 25 × 1 ملم) بتسجيله قطره 1 سم واحد في نهاية الحلقة باستخدام أداة الحفر الزجاج. بدلا من ذلك ، يمكن شراء شرائح مجهرية مع الدوائر قبل محفورا اثنين (على سبيل المثال فيشر العلمية أو مصادر EMS). وستكون هناك حاجة شريحة واحدة من الزجاج في البعوض.
- سحبت إعداد مجموعة من الإبر الزجاجية (انظر المواد) وفقا للإعدادات المقترحة التالية (سوتر الآلات ، الموديل P - 87) :
الحرارة منحدر +5 سحب : 45 فيل : 75 الوقت : 175 الضغط 580
باستخدام الإعدادات المقترحة على هذا مجتذب ، ونحن بناء الإبر التي هي حوالي 500 ملم في الطول الاجمالي بأطوال عرقوب من حوالي 3 ملم. ويمكن أيضا قبل سحب الإبر يمكن شراؤها (على سبيل المثال Tritech للبحوث).
2. إعداد microinjector مقدما لجمع كرية دموية
- ادخال ابرة سحبت في ماسك الإبرة microinjector وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. سحبت الردم (انظر المواد) microinjector الأنابيب ، المحاقن والإبر والزجاج مع الزيوت المعدنية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
3. إعداد إناث البعوض مقدما لجمع كرية دموية
- 15 نضح الإناث البالغات في قفص صغير الحاويات الصلبة التي يمكن أن تكون على اتصال مع الجليد. تزج في قفص مع البعوض الجليد عميقة بما فيه الكفاية بحيث ارتفاع كامل من القفص وجميع الاطراف على اتصال مع الثلج. وسوف يضمن هذا سوف يتعرض كل البعوض للبرد.
البرد البعوض تخدير لمدة حوالي 8 أو حتى أنها لم تعد المحمول. - مكان واحد البعوض على شريحة الاكتئاب. وسوف تخدم هذه الشريحة كموقع للحقن.
4. جمع كرية دموية
- تعيين microinjector اتخاذ بزيادة 12 ميكرولتر من مخفف الدملمف إبرة في الزجاج وسحب حقن المحلول في البعوض بين شرائح البطن السابع والثامن. ويمكن حقن حوالي 3 البعوض مع 3-3،5 ميكرولتر من حجم مجموع 12 ميكرولتر تناولها. يجب أن يكون البعوض الذي عقد في مكان بلطف مع ملقط بينما يتم تنفيذ الحقن. وينبغي أن صغر حجم مخفف تبقى في رأس الإبرة ، وذلك لمنع الزيوت المعدنية من حقنها. بعد الحقن يجب أن ننظر في البطن "مليئة" أو المتضخمة.
- مكان حقن البعوض في وعاء نظيف منفصلة على الجليد لاستعادة لمدة 5 دقائق. فإن الحضانة من الحل مخفف للتخثر داخل البعوض مساعدة طرد hemocytes التمسك الأنسجة الداخلية. يمكن أن يتم حقنه في المتوسط 3-5 البعوض جديدة خلال كل فترة الانتعاش 5 دقيقة.
- بعد 5 دقائق من القصاصة ، والانتعاش أرجلهم ، والأجنحة ، وغيض من البطن (في الجزء الثامن) من كل واحد في وقت واحد البعوض باستخدام المقص الصغير. وينبغي أن يتم ذلك في كوب الانتعاش وضعت على الجليد. قطع الأرجل والأجنحة يقلل من احتمال نقله إلى جداول الشرائح المجموعة. ملاحظة : لا قطع الأرجل والأجنحة قريبة جدا من مواقع الحجز الصدرية أو هل خطر إيجاد فرص أخرى للالدملمف من الفرار. يجب فقط الدملمف يتم تجميعها من خلال افتتاح إنشاؤها في غيض من البطن.
- تغسل شريحة واحدة من الزجاج المحفور المجهر مع الايثانول 70 ٪ وجففه مع kimwipe. موقف واحد وحقنه تعافى البعوض على الشريحة على الحافة الخارجية للدائرة محفورا. تعيين microinjector لالتقاط 12 ميكرولتر من مخفف الدملمف الطازجة وحقن هذا الحجم في البعوض في الجانب الوحشي من mesothorax والخمسين. تسليم أكثر ولكن ليس كلها من حجم مخفف (حوالي 8-10 ميكرولتر) وذلك لمنع الزيوت المعدنية من حقنها. وينبغي أن صغر حجم مخفف تبقى في رأس الإبرة.
- موقف البعوض بحيث افتتاح قطع البطن هو على حافة دائرة 1 سم. وينبغي أن يكون بعد الحقن جمع الدملمف المخفف داخل منطقة ملحوظ. بمجرد إزالة الإبرة من موقع الحقن mesothoracic ، واستئناف عقد البعوض بين ذراعي اثنين من الملقط والضغط برفق في البطن مع تلك ملقط لتوجيه الدملمف على منطقة دائرة محفورا.
- تسمح الدملمف المخفف لتجف على الشريحة لحوالي 10 دقيقة أو حتى يجف بشكل ملحوظ.
5. كرية دموية التثبيت وتلطيخ
- وصمة عار على انفراد مع كل شريحة HEMA3 7 (انظر المواد) : اغمس لياليLIDE 5 مرات في تثبيتي لل1 ثانية في كل مرة ؛ Dipslide في الحل الأول : 1 3 مرات في كل ثانية ، وأخيرا ، وتراجع الشريحة الثانية في حل 3 مرات في كل ثانية : 1. شطف الجزء الخلفي من الشريحة بالماء DI. لا ينبغي أن الجبهة الشريحة شطفها. وصمة عار الجافة الجبهة من الشريحة خارج الدائرة التي تحتوي على نسيج ملون محفورا.
- تطبيق المتوسطة المتزايدة (على سبيل المثال شور / جبل أو Polymount) حول مركز محفورا ومكان زلة تغطية على ذلك. اضغط لأسفل برفق على تغطية زلة (25 x 25 ملم) بحيث ينتشر المتوسطة المتزايدة للمنطقة بأكملها التي يغطيها تغطية زلة (بما في ذلك دائرة محفورا تحتوي على نسيج ملون). تسمح الشرائح لتجف لمدة لا تقل عن 3 ساعات أو خلال الليل. وينبغي أن ينظر في حدود 2 Hemocytes الأسابيع التالية لجمع التصور الأمثل والتصوير.
6. ممثل النتائج
وترد أمثلة hemocytes ملطخة الثابتة وHEMA3 جمعت من إناث بعوض الزاعجة الكبار في الشكل 1A - C. 1A الرقم يدل على كرية دموية التي حددناها بوصفها prohemocyte على أساس حجم صغير شكله كروي ، كروية ، وارتفاع نسبة النووية إلى السيتوبلازم (550x التكبير) 11. 1B الرقم يدل على كرية دموية تصنف باعتبارها oenocytoid على أساس شكلها كروي والسيتوبلازم نسبة عالية لالنووي (550x التكبير). أخيرا ، يظهر الشكل 1C كرية دموية محببة من نوع (550x التكبير). المحببة هي أكثر تفصيلا في طبيعتها ، وتميل إلى أن تكون أكثر amoeboid في الشكل والسلوك وثباتهم على السطوح الزجاجية. باستخدام معايير سبق نشرها لكتابة كرية دموية والإنعاش 11 ، أسفرت عن اسلوبنا جمع عدد مماثل من مجموع hemocytes ووجدنا أيضا أنه المحببة يشكلون النسبة الأكبر من مجموع hemocytes 11 (الشكل 2).
الشكل 1. صور المجهر الخفيفة ممثل HEMA3 prohemocyte ، ثابتة الملون (A) ، oenocytoid (B) ، والكريات البيضاء (C) من AE. بعوض البالغات. C = السيتوبلازم ، N = G = نواة الحبيبات.
الشكل 2. بحساب إجمالي ± SE جميع hemocytes والمحببة لكل أنثى البعوض التي تم الحصول عليها عن طريق تخفيف الدملمف لدينا وطريقة جمعها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وصف طريقة جمع كرية دموية هنا هو معدلة من أساليب المنشورة سابقا ويسمح احد لعزل الاستعدادات نظيف hemocytes من البعوض الزاعجة مع عدد أقل من الخطوات. في حين تكمن مصلحتنا ولا سيما في وصف السكان كرية دموية في البعوض الزاعجة ، ونحن نعتقد أنه يمكن تطبيق هذه التقنية لمجموعات أخرى من البعوض بعد وتجرى التجارب الأولية لتحديد حجم الحقن. بروتوكول يستخدم لدينا مخازن للتخثر في مكان من محلول ملحي وينتج سكان hemocytes أن يعكس بدقة الأرقام في الجسم الحي. ومع ذلك ، فإننا لم تحدد بعد مدى ملاءمتها لدينا بروتوكول للحفاظ على hemocytes معزولة في الثقافة.
وقد تبين أن مجموعة من الدملمف عبر خرطوم لخفض العائد على أقل عدد من hemocytes المتداولة ولن يكون مزيد من المناقشة هنا. نضح المستندة إلى أساليب ، بينما من السهل أن يجري ، قد تعرضت لانتقادات لسماحه قدرا أكبر من التلوث من الأنسجة الداخلية وموازين 11. في الآونة الأخيرة ، وضعت عالية حقن / الإنعاش طرق لتحسين استرداد hemocytes ، في حين أن الحد من مستويات تلوث 11 ، ولكن ينطوي على عدد من الخطوات الحقن وجمع. الحصول على بروتوكول لدينا نفس المستوى من hemocytes تعافى وخفض الملوثات ولكن بعدد أقل من الحقن وخطوات جمع ، مما يوفر وسيلة بسيطة ولكنها دقيقة للحصول على الاستعدادات hemocytes نظيف. أولا ، في خطوة بسيطة لدينا بروتوكول إزالة الساقين ، وأجنحة وغيض من البطن في حاوية منفصلة من حيث النتائج التي تم جمعها في التحضيرات الدملمف أنظف بكثير من hemocytes. الثانية ، ودقة لدينا طريقة المكاسب من خلال الاستفادة من الإبر والزجاج الذي عقد في حامل إبرة تعلق على microinjector إيجابية التشرد. في حين يمكن أن تكون كذلك مخفف باستخدام حقن الإبر باليد أو غيرها من الأجهزة التسليم باليد ، واستخدام microinjector يزيد من دقة التنفيذ وحجم النتائج في وقت لاحق في حجم ثابت من الدملمف جمعها. محاكمات لدينا تشير إلى أن أحجام التداول المشترك للحقن 9،5-10،5 ميكرولتر (الخطوات 4.1 و 4.4) يسمح لنا باستمرار لجمع 90-10 ميكرولتر من الدملمف من إناث البعوض حقن (بيانات غير منشورة) ، وبالتالي توفير قدر من الاتساق آخر في قياس السكان كرية دموية. لدينا وسيلة لجمع يبسط العامة عن طريق إزالة الحاجة إلى حقن الإبر باليد الأخرى و / أو أنابيب الزجاج الشعرية لجمع الدملمف المخفف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
والكتاب أود أن أشكر جون بيترسون وفري بن لتربية البعوض. ونحن نشكر أيضا كريستين ديفيس وراديس غاري للمساعدة في micrographs كرية دموية. وقد تم تمويل هذا البحث من جامعة ريتشموند في الآداب والعلوم زمالة الصيف لAA القيوم وأعضاء هيئة التدريس ألف منحة لTelang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Schneider’s Medium | Sigma-Aldrich | S0146 | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F0643 | |
| Hema3 stain kit | Fisher Scientific | 123-869 | |
| Glass needles (borosilicate with filament) | Sutter Instrument Co. | BF100-78-10 | 1.0mm O.D. and 0.78mm I.D. |
| Needle puller | Sutter Instrument Co. | Model P-87 | |
| MicroInjector | Tritech Research, Inc. | MINJ-PD | |
| Needle holder | Tritech Research, Inc. | MINJ-4 |
References
- Enayati, A., Hemingway, J. Malaria management: past, present, and future. Annu. Rev. Entomol. 55, 569-569 (2010).
- Medlock, J., Luz, P. M., Struchiner, C. J., Galvani, A. P. The impact of transgenic mosquitoes on dengue virulence to humans and mosquitoes. The American Naturalist. 174, 565-565 (2009).
- Baton, L. A., Garver, L., Xi, Z., Dimopoulos, G. Functional genomics studies on the innate immunity of disease vectors. Insect Sci. 15, 15-15 (2008).
- Thomas, R. E., Wu, W. K., Verleye, D., Rai, K. S. Midgut basal lamina thickness and dengue-1 virus dissemination rates in laboratory strains of Aedes albopictus (Diptera: Culicidae). J. Med. Entomol. 30, 326-326 (1993).
- Bartholomay, L. C. Profiling infection responses in the haemocytes of the mosquito, Aedes aegypti. Insect Mol. Biol. 16, 761-761 (2007).
- Strand, M. R. The insect cellular immune response. Insect Sci. 15, 1-1 (2008).
- Hillyer, J. F. Age-associated mortality in immune challenged mosquitoes (Aedes aegypti) correlates with a decrease in haemocyte numbers. Cell. Microbiol. 7, 39-39 (2005).
- Chen, C. C., Laurence, B. R. In vitro study on humoral encapsulation of microfilariae: establishment of technique and description of reaction. International Journal for Parasitology. 17, 781-781 (1987).
- Beerntsen, B. T., Christensen, B. M. Dirofilaria immitis: effects on hemolymph polypeptide synthesis in Aedes aegypti during melanotic encapsulation reactions against Microfilariae. Exp. Parasitol. 71, 406-406 (1990).
- Hillyer, J. F., Schmidt, S. L., Christensen, B. M. The antibacterial innate immune response by the mosquito Aedes aegypti is mediated by hemocytes and independent of Gram type and pathogenicity. Microb. Infect. 6, 448-448 (2004).
- Castillo, J. C., Robertson, A. E., Strand, M. R. Characterization of hemocytes from the mosquitoes Anopheles gambiae and Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 36, 891-891 (2006).
