Summary
ويستخدم فحص أنبوب تشكيل لتقييم نشاط الأوعية الدموية للخلايا السرطانية.
Abstract
على مدى العقود العديدة الماضية ، وهي مقايسة تشكيل باستخدام أنبوب عامل نمو مخفض تم Matrigel يعملون عادة للتدليل على النشاط عائية من خلايا بطانة الأوعية الدموية في المختبر 1-5. ومع ذلك ، فقد أظهرت أدلة متزايدة مؤخرا ان لا يقتصر هذا الاختبار لاختبار سلوك الأوعية الدموية للخلايا بطانة الأوعية الدموية. بدلا من ذلك ، كما تم استخدامها لاختبار قدرة عدد من الخلايا السرطانية لتطوير النمط الظاهري الأوعية الدموية 6-8. وهذه القدرة بما يتفق مع سلوكهم مكون للأوعية التي تم تحديدها في الحيوانات xenotransplanted ، وهي عملية تعرف باسم مكون للأوعية المحاكاة (VM) 9. هناك العديد من الأدلة تثبت أن الخلية السرطانية بوساطة VM تلعب دورا حيويا في تطوير الورم ، ومستقلة عن الأوعية الدموية الخلية البطانية 6 ، 10-13. على سبيل المثال ، تم العثور على الخلايا السرطانية للمشاركة في الدم perfused ، وتشكيل قناة الأوعية الدموية في عينات من الانسجة من المرضى سرطان الجلد وورم أرومي دبقي 8 ، 10 ، 11. هنا ، وصفنا هذا الاختبار شبكة أنبوبية ، باعتبارها أداة مفيدة في تقييم نشاط مكون للأوعية من خلايا الورم. وجدنا أن بعض خطوط الخلايا السرطانية مثل سرطان الجلد B16F1 خلايا ورم أرومي دبقي U87 خلايا ، وسرطان الثدي MDA - MB - 435 الخلايا قادرة على تشكيل الأنابيب الأوعية الدموية ، ولكن البعض لا مثل سرطان القولون HCT116 الخلايا. وعلاوة على ذلك ، فإن هذا النمط الظاهري الأوعية الدموية تعتمد على الأرقام الخلية مطلي على Matrigel. لذا ، قد يكون هذا الفحص بمثابة أداة قوية لفحص الأوعية الدموية المحتملة لمجموعة متنوعة من أنواع الخلايا بما فيها خلايا الأوعية الدموية ، والخلايا السرطانية فضلا عن خلايا أخرى.
Protocol
1. تشكيل الأنبوبة Matrigel القائم على الفحص لتقييم نشاط الخلايا السرطانية مكون للأوعية
- ونمت الخلايا السرطانية في الدماغ مثل U87 الخلايا خلايا سرطان الجلد B16F1 ، وسرطان الثدي MDA - MB - 435 ، وخلايا سرطان القولون في HCT116 DMEM تستكمل مع FBS 10 ٪ والبنسلين / الستربتوميسين (جميع من Invitrogen : إعداد الخلايا السرطانية والخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة ). وكانت الخلية البطانية مثقف خط خلايا بطانة الاوعية الدموية الدقيقة (HMVECs) في EBM2 المتوسطة (Lonza) تستكمل مع هيدروكورتيزون ميكروغرام / 1 مل و 1 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة ، و 10 ٪ FBS والبنسلين / الستربتوميسين. وكانت تغسل مع الخلايا ثلاث مرات منفصلة مع برنامج تلفزيوني و0.05 ٪ التربسين / EDTA (Invitrogen). بعد الطرد المركزي مع 2000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق ، وكانت الخلية الكريات غسلها مرة أخرى مع برنامج تلفزيوني. ثم تم فرز الخلايا مكعبات مع عدادة الكريات.
- Matrigel إعداد : حدث قسامة من النمو وانخفاض عامل تحسنت Matrigel دينار بحريني (العلوم البيولوجية) حتى في درجة حرارة الغرفة. قبل إذابة تماما ، ونقلت على الجليد وكان يحتفظ السائل على الثلج لمدة لا تقل عن 10 دقيقة. ثم كان مطلي 50 ميكرولتر من Matrigel إلى 96 - جيدا لوحات على المستوى الأفقي الذي يسمح لتوزيع Matrigel بالتساوي ، وحضنت لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- تشكيل أنبوب : خلايا كانت (1-2 × 10 4) إعادة العالقة مع المصل خالية DMEM عن الخلايا السرطانية أو EBM - 2 لخلايا بطانة الأوعية الدموية ، وتحميلها على الجزء العلوي من Matrigel. إذا تم استخدام هذا الاختبار لقياس تأثير بعض العوامل على التنمية أنبوبية ، وأضيفت هذه العوامل (محفزات أو مثبطات) إلى المتوسطة المصل الحرة. يرد كل مجموعة الشرطي 4-6 الآبار.
- الصور وتحليل البيانات : في الحضانة وبعد 37 درجة مئوية خلال الليل ، تم تحليل كل بئر مباشرة تحت المجهر. إذا كانت هناك حاجة لتثبيت الأنابيب ، وأضيف بلطف 100 ميكرولتر من 10 ٪ محلول ملحي المستندة الفورمالين وعشر دقائق في وقت لاحق ، انها مستعدة لتحليلها. تحت المجهر مع النقيض من المرحلة 10X ، تم تصوير الأنابيب في كل حقل ، وكان يحسب بمتوسط نبيبات 3-5 حقول عشوائية في كل بئر.
2. ممثل النتائج :
واستخدمت HMVECs كعنصر تحكم إيجابية ، حيث وضعت هذه الأنابيب واضحة من أجسام الخلايا التي تربط ممدود لتشكيل شبكة مضلع. B16F1 ، U87 ، ونجمة داود الحمراء ميغابايت 435 الخلايا المتقدمة نبيبات الأوعية الدموية مشابهة لتلك التي شكلتها HMVECs ، ولكن لم HCT116 الخلايا (الشكل 1). تم اختبار أنبوب تشكيل خلية تعتمد على الجرعة في U87 الخلايا. شكلت خلايا 10000 كما هو موضح في الشكل 2 ، نبيبات وقفها. مرة واحدة وتضاعف الخلايا ، وشبكة الأوعية الدموية صلبة مماثلة لتلك التي ظهرت في HMVECs. في المقابل ، فشل الخلايا أقل من 5000 لتشكيل النمط الظاهري في الأوعية الدموية.
الشكل 1. الأنبوبة الناجم عن تشكيل HMVECs ، U87 ، MDA - MB - 435 ، وخلايا B16F1 ، ولكن لا تم تحميلها HCT116 خلايا جميع الخلايا (2 × 10 4) على Matrigel وحضنت بين عشية وضحاها. وكانت المصورة باستخدام الأنابيب النقيض المرحلة. واستخدمت HMVECs كعنصر تحكم إيجابية. وعرضت ممثلة 3-5 المجالات. شريط : 100 ميكرومتر.
واستخدمت الشكل 2. U87 الخلية التي يسببها نبيبات في عدد الخلايا التي تعتمد على الطريقة. أعداد مختلفة من الخلايا U87 كما هو مبين في زوايا لتشكيل الأنبوب. كانت تستخدم لمراقبة HMVECs إيجابية. شريط : 100 ملم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
من أجل هذا الاختبار أن تنجح ، يجب اختبار نوعية Matrigel الأولى. ويمكن الحصول على عينة صغيرة من العلوم البيولوجية دينار بحريني إلى ما قبل تشغيل الفحص باستخدام HMVECs. قد منتجات مختلفة دفعة عرض الصفات التي تختلف بعض الكثير لا توفر شرط الأمثل لتشكيل الأنبوب. ثانيا ، ينبغي تجنب أي فقاعات عندما يتم تحميل وقسامة من Matrigel في لوحات 96 - جيدا ، لأن الفقاعات يمكن أن تعطل تشكيل نبيب. إذا تم العثور على فقاعات صغيرة في بئر ، يمكن Matrigel انتقلت على الفور إلى أنابيب Matrigel الأصلية التي يجب أن تبقى على الجليد أثناء التجربة. بالإضافة ، ينبغي الحفاظ على خلايا اختبارها في معدل النمو في مرحلة السجل. عندما تشير إلى أي شروط المثقف النمو البطيء للخلايا يحدث ذلك ، ينبغي استبدالها الخلايا السليمة. أخيرا ، يجب تحليل أنابيب تحت المجهر بمدة لا تتجاوز ساعة واحدة إذا لم يتم إصلاح الأنابيب بسبب انخفاض درجة الحرارة (درجة حرارة الغرفة) قد يؤثر على تشكيل الأنبوب. وينبغي أن يتم الانتهاء من فحص كامل في غضون 24 ساعة لتجنب اضطراب هيكل أنبوبي الناجم عن موت الخلايا. ومن المعروف جيدا أن يتسم تشكيل الأنبوب من العمليات الخلوية تنشيط متعددة بما في ذلك الهجرة الخلية ، خلية التصاق الخلايا والبقاء ، وموت الخلايا المبرمج. على سبيل المثال ، والهجرة ، وخلية خلية خلية التصاق هي ملحوظ خلال وضع أنبوب. بعد 24 ساعة ، ومع ذلك ، موت الخلايا المبرمج خلية كبيرة تجري كما لوحظ بشكل متزايد شبكة وقفها. هذا الحدث يحدث في كل خلية الورم البطاني وتشكيل خلية أنبوب المشتقة.
فمن الناشئة أن هذا الفحص هو أمر حاسم لتقييم نشاط مكون للأوعية خلية السرطانية في المختبر ، الحدث الذي هو مستقل عن الخلية الأوعية الدموية المرتبطة البطانية. هنا ، لقد أظهرنا أن خلية سرطان الجلد وسرطان الثدي B16F1 خط خط سرطان MDA - MB - 435 شبكات الأوعية الدموية وضعت على Matrigel ، بما يتفق مع السلوك مكون للأوعية من هذه الأنواع من الأورام في الإنسان ، وكذلك في النماذج الحيوانية 14-17. على الرغم من أن الفشل في تطوير النمط الظاهري الأوعية الدموية التي HCT116 الخلايا على Matrigel غير معروف ميكانيكيا ، وتكهن بأن هذه الخاصية قد تكون الأوعية الدموية السرطانية تعتمد على نوع من الخلايا. سيكون من المثير للاهتمام معرفة ما إذا كانت الخلايا HCT116 عدم القدرة على توليد VM المجراة مقارنة مع B16F1 والخلايا MDA - MB - 435. ولذلك ، وإنشاء هذا الاختبار هو أمر بالغ الأهمية في دراسة بيولوجيا السرطان ، بيولوجيا الأوعية الدموية وكذلك فحص المخدرات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل لجنة التحقيق الوطنية R01 CA120659 (RS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11995 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | BD Biosciences | 47743-720 | |
| EBM2 kit | Lonza Inc. | CC-3156 | |
| Nikon ECLIPSE TS100 microscope | Nikon Instruments |
References
- Shao, R., Guo, X. Human microvascular endothelial cells immortalized with human telomerase catalytic protein: a model for the study of in vitro angiogenesis. Biochemical & Biophysical Research Communications. 321, 788-794 (2004).
- Ribeiro, M. J. Hemostatic properties of the SV-40 transfected human microvascular endothelial cell line (HMEC-1). A representative in vitro model for microvascular endothelium. Thromb Res. 79, 153-1561 (1995).
- Ades, E. W. HMEC-1: establishment of an immortalized human microvascular endothelial cell line. J Invest Dermatol. 99, 683-690 (1992).
- Shao, R. Acquired expression of periostin by human breast cancers promotes tumor angiogenesis through up-regulation of vascular endothelial growth factor receptor 2 expression. Molecular & Cellular Biology. 24, 3992-4003 (2004).
- Shao, R. YKL-40, a secreted glycoprotein, promotes tumor angiogenesis. Oncogene. 28, 4456-4468 (2009).
- Basu, G. D. A novel role for cyclooxygenase-2 in regulating vascular channel formation by human breast cancer cells. Breast Cancer Research. 8, R69-R69 (2006).
- Scavelli, C. Vasculogenic mimicry by bone marrow macrophages in patients with multiple myeloma. Oncogene. 27, 663-674 (2008).
- El Hallani, S. A new alternative mechanism in glioblastoma vascularization: tubular vasculogenic mimicry. Brain. 133, 973-982 (2010).
- Maniotis, A. J. Vascular channel formation by human melanoma cells in vivo and in vitro: vasculogenic mimicry. American Journal of Pathology. 155, 739-752 (1999).
- Hendrix, M. J., Seftor, E. A., Hess, A. R., Seftor, R. E. Vasculogenic mimicry and tumour-cell plasticity: lessons from melanoma. Nature Reviews Cancer. 3, 411-421 (2003).
- Folberg, R. Tumor cell plasticity in uveal melanoma: microenvironment directed dampening of the invasive and metastatic genotype and phenotype accompanies the generation of vasculogenic mimicry patterns. American Journal of Pathology. 169, 1376-1389 (2006).
- Liu, C. Prostate-specific membrane antigen directed selective thrombotic infarction of tumors. Cancer Research. 62, 5470-5475 (2002).
- Sood, A. K. The clinical significance of tumor cell-lined vasculature in ovarian carcinoma: implications for anti-vasculogenic therapy. Cancer Biology & Therapy. 1, 661-664 (2002).
- Shirakawa, K. Hemodynamics in vasculogenic mimicry and angiogenesis of inflammatory breast cancer xenograft. Cancer Research. 62, 560-566 (2002).
- Ruf, W. Differential role of tissue factor pathway inhibitors 1 and 2 in melanoma vasculogenic mimicry. Cancer Research. 63, 5381-5389 (2003).
- Seftor, R. E. Cooperative interactions of laminin 5 gamma2 chain, matrix metalloproteinase-2, and membrane type-1-matrix/metalloproteinase are required for mimicry of embryonic vasculogenesis by aggressive melanoma. Cancer Research. 61, 6322-6327 (2001).
- Shirakawa, K. Vasculogenic mimicry and pseudo-comedo formation in breast cancer. International Journal of Cancer. 99, 821-828 (2002).
