En Matrigel-Based Tube Formation analys för att bedöma vaskulär aktivitet av tumörceller

Summary

Ett rör formation analys används för att utvärdera vaskulär aktivitet tumörceller.

Abstract

Under de senaste decennierna, ett rör bildandet analysen med tillväxtfaktor-reducerad Matrigel har vanligtvis används för att visa angiogena aktiviteten av vaskulära endotelceller in vitro ^1-5. Emellertid har nyligen växande bevis visar att denna analys inte är begränsat för att testa vaskulära beteende för endotelceller. Istället även den har använts för att testa förmågan hos ett antal tumörceller för att utveckla en vaskulär fenotyp ^6-8. Denna funktion överensstämde med deras vaskulär beteende identifieras i xenotransplanted djur, en process som kallas vaskulär mimicry (VM) ^9. Det finns en mängd bevis som visar att tumören cellmedierad VM spelar en viktig roll i tumörutveckling, oberoende av endotelceller angiogenes ^{6, 10-13.} Till exempel var tumörceller funnit att delta i blodet perfusion, kärl-kanalen bildas i vävnadsprover från melanom och glioblastom patienter ^{8, 10, 11.} Här beskrivs vi detta tubulär nätverk analys som ett användbart verktyg i utvärderingen av vaskulär aktivitet av tumörceller. Vi fann att vissa tumörceller linjer såsom melanom B16F1 celler, glioblastom U87 celler och bröstcancer MDA-MB-435 celler kan bilda vaskulära tubuli, men inte alla såsom coloncancer HCT116 celler. Dessutom är detta vaskulär fenotyp beroende av cell nummer pläterade på Matrigel. Därför kan denna analys fungera som kraftfulla verktyg för att skärmen vaskulär potentialen i ett antal olika celltyper, inklusive vaskulära celler, tumörceller och andra celler.

Protocol

1. En Matrigel-Based Tube Formation analys för att bedöma vaskulär aktivitet av tumörceller

1. Beredning av tumörceller och mikrovaskulära endotelceller: hjärntumör celler såsom U87 celler, melanom celler B16F1, bröstcancer MDA-MB-435, och celler kolon HCT116 odlades i DMEM kompletterad med 10% FBS och penicillin / streptomycin (alla från Invitrogen ). Endotel linje mänskliga mikrovaskulära endotelceller (HMVECs) odlades i EBM2 medium (Lonza) kompletteras med 1 mikrogram / ml hydrokortison och 1 ng / ml epidermal tillväxtfaktor, 10% FBS och penicillin / streptomycin. Cellerna sköljdes med PBS tre gånger och fristående med 0,05% trypsin / EDTA (Invitrogen). Efter centrifugering med 2000 rpm i 5 minuter var cell pellets tvättas igen med PBS. Då var det pelleterat celler räknas med en hemocytometer.
2. Matrigel förberedelser: Ett delprov av tillväxtfaktor-reducerad Matrigel (BD Bioscience) värmdes upp vid rumstemperatur. Innan smält fullständigt, var det överförs till isen och dess flytande hölls på is i minst 10 min. Sedan 50 ìl Matrigel var klädd till 96-brunnar på en övergripande nivå som gör att Matrigel att fördela jämnt, och inkuberas i 30 minuter vid 37 ° C.
3. Rör formation: Cells (1-2 x 10 ⁴⁾ var resuspenderas med serumfritt DMEM för tumörceller eller EBM-2 för endotelceller, och lastas på toppen av Matrigel. Om denna analys har använts för att mäta effekterna av vissa aktörer på tubuli utvecklingen var dessa medel (stimulatorer eller inhibitorer) läggs till serumfritt medium. Varje villkorlig grupp innehöll 4-6 brunnar.
4. Bild-och dataanalys: Efter inkubation vid 37 ° C över natten, var varje brunn analyseras direkt i mikroskop. Om tubuli behövdes för fixering, var 100 l 10% formalin saltlösning-baserad lösning försiktigt läggas och tio minuter senare var det färdigt för analys. Under ett mikroskop med 10x faskontrast var tubuli i varje fält avbildas och ett genomsnitt av tubuli 3-5 slumpmässigt fält i varje brunn räknades.

2. Representativa resultat:

HMVECs användes som positiv kontroll, eftersom dessa tubuli har utvecklats ifrån klart långsträckt cell organ som ansluts för att bilda polygon nätverk. B16F1, U87, och MDA-MB-435 celler utvecklade vaskulär tubuli liknar dem som bildas av HMVECs, men HCT116 celler inte (figur 1). En cell dosberoende rör bildning testades i U87 celler. Som framgår av Figur 2, bildade 10.000 celler avbrytas tubuli. När cellerna var fördubblades, var en solid vaskulär nätverk jämförbara med de som ses i HMVECs. Däremot misslyckades celler mindre än 5000 för att bilda en vaskulär fenotyp.

Figur 1. Tube bildning orsakad av HMVECs, U87, MDA-MB-435, och B16F1 celler, men inte HCT116 celler. Alla celler (2 x 10 ⁴⁾ lastades på Matrigel och inkuberas över natten. Tubuli var avbildas med faskontrast. HMVECs användes som positiv kontroll. En företrädare för 3-5 fälten visades. Bar: 100 ìm.

Figur 2. U87 cell-inducerad tubuli i en cell nummer-beroende sätt. Olika antal U87 celler som anges i hörnen användes för rör bildas. HMVECs användes till en positiv kontroll. Bar: 100 mm.

Discussion

För att denna analys ska lyckas bör kvaliteten på Matrigel testas först. Ett litet urval kan erhållas från BD Bioscience att i förväg köra analysen med HMVECs. Olika parti produkter kan visas olika kvaliteter där vissa partier inte ger en optimal förutsättning för att tub bildas. För det andra bör alla bubblor undvikas när en delmängd av Matrigel laddas i 96-håls plattor, eftersom bubblor kan störa tubuli bildas. Om små bubblor finns i en brunn, kan Matrigel omedelbart flyttas tillbaka till den ursprungliga Matrigel rör som ska hållas på is under experimentet. Dessutom bör testas celler skall hållas i tillväxt på en stock fas. När någon odlade villkor som anger långsamma tillväxten av de celler uppträder bör de ersättas med friska celler. Slutligen bör en analys av rör under ett mikroskop vara längre än en timme om rören inte är fasta eftersom minskad temperatur (rumstemperatur) kan påverka rör bildas. Hela analysen bör vara avslutad inom 24 timmar för att undvika avbrott i tubulär struktur som orsakas av celldöd. Det är väl känt att röret bildningen kännetecknas av flera cellulära-aktiverade processer inklusive cell migration, cell-cell adhesion, överlevnad och apoptos. Till exempel, cell migration och cell-cell adhesion är märkbara under röret utveckling. Efter 24 timmar tar dock betydande cell apoptos plats som avvecklad nätverk blir allt observerats. Denna händelse inträffar i både endotelceller och tumör-cellerna rör formation.

Det är fram som denna analys är avgörande för utvärdering tumöraktivitet cell vaskulär in vitro, det fall som är oberoende av endotelceller-associerad angiogenes. Här har vi visat att melanom cellinje B16F1 och bröstcancer linje MDA-MB-435 utvecklades vaskulära nätverk på Matrigel, i linje med vaskulär beteendet hos dessa typer av tumörer hos människa och i djurmodeller ^14-17. Trots misslyckandet med att utveckla en vaskulär fenotyp av HCT116 celler på Matrigel är mekaniskt okänd, är det spekulerats i att detta vaskulära egendomen får tumörcellen typ beroende. Det skulle vara intressant att veta om HCT116 cellerna saknar förmåga att generera VM in vivo jämfört med B16F1 och MDA-MB-435 celler. Därför är inrättandet av denna analys av yttersta vikt i studien av cancer biologi, vaskulär biologi samt drog screening.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11995
FBS	Invitrogen	16000-044
Growth factor-reduced Matrigel	BD Biosciences	47743-720
EBM2 kit	Lonza Inc.	CC-3156
Nikon ECLIPSE TS100 microscope	Nikon Instruments