ARNi Mediated inactivation génique et la transgénèse par microinjection dans le nématode Necromenic Pristionchus pacificus</em
Summary
Dans les organismes modèles, la transgénèse permet de manipuler les fonctions des gènes tandis ARNi peut knockdown transcrits d'ARNm spécifiques 1-2. Ce protocole vise à illustrer les techniques nécessaires pour introduire de l'ADN transmis de façon stable et transitoire ARN double brin dans le nématode necromenic<em> Pristionchus pacificus</em> Pour des études en biologie évolutive, de développement et de comportement.
Abstract
Bien qu'il soit plus abordable pour les organismes modèles émergents d'obtenir les génomes entièrement séquencés, encore en profondeur la fonction des gènes et des analyses d'expression par interférence ARN et de transgénèse stables restent limitées dans de nombreuses espèces en raison de l'anatomie particulière et moléculaire biologie cellulaire de l'organisme. Par exemple, en dehors de la couronne de Caenorhabditis groupe qui comprend trois Caenorhabditis elegans, de façon stable transmis lignées transgéniques chez les non-Caenorhabditis espèces n'ont pas été signalés dans ce phylum spécieuse (Nematoda), à l'exception de Strongyloides stercoralis 4 et 5 Pristionchus pacificus. Pour faciliter l'expansion du rôle de P. pacificus dans l'étude du développement, l'évolution et le comportement 6-7, nous décrivons ici les méthodes actuelles d'utiliser la micro-injection pour rendre les animaux transgéniques et inactivation de gènes par RNAi. Comme les gonades des <em> C. elegans et la plupart d'autres nématodes, les gonades de P. pacificus est syncytial et capable d'incorporer de l'ADN et l'ARN dans les ovocytes sont envoyés par micro-injection directe. Contrairement à C. elegans Cependant, l'héritage transgène stable et expression somatique dans P. pacificus nécessite l'ajout d'ADN génomique digéré par les endonucléases auto complémentaire à l'extrémité des transgènes cibles et des marqueurs co-injection 5. L'ajout de l'ADN génomique porteuse est similaire à l'exigence de l'expression du transgène dans le Strongyloides stercoralis 4 et dans les cellules germinales de C. elegans. Toutefois, il n'est pas clair si l'exigence spécifique de l'ADN des animaux génomiques propres parce que P. pacificus soma est très efficace à réduire au silence non complexes multi-copie des gènes ou que les tableaux extrachromosomique dans P. pacificus nécessitent séquences génomiques pour l'assemblage kinétochore correcte lors de la mitose. La migration ventrale de l'(deux arméesdidelphic) gonades hermaphrodites complique encore plus la capacité d'injecter deux gonades dans les vers individuels 8. Nous démontrons également l'utilisation de micro-injection d'un mutant dominant knockdown (rouleau, tu92) en injectant l'ARN double brin (ARNdb) dans les gonades d'obtenir non roulants F 1 progéniture. Contrairement à C. elegans, mais comme la plupart des autres nématodes, P. pacificus PS312 n'est pas réceptif à l'ARNi systémique via l'alimentation et le trempage et donc ARNdb doivent être administrés par microinjection dans les gonades syncytial. Dans cette étude, nous espérons pour décrire le processus de microinjection nécessaires pour transformer un promoteur PPA-EGL-4:: Un journaliste de fusion GFP et démontable d'un rouleau dominante PRL-1 (tu92) mutant dans un protocole visuel informatif.
Protocol
Discussion
Populations de P. pacificus sont trouvés en association étroite avec diverses espèces de scarabées dans le monde et est un nématode modèle intermédiaire entre vivre libre et les nématodes parasitaires. La force du P. pacificus comme un organisme modèle émergent réside dans l'intégration de ses cartes génétiques et physiques qui favorisent la cartographie de positionnement des mutants isolés de impartiale écrans avant génétique (c'est à dire pas seulement pour les gè…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs sont très reconnaissants à RJ Sommer et X Wang pour l'aide aux micro-injection, ainsi que des commentaires perspicaces de la évaluateurs anonymes. Ce travail est soutenu par le NIH octroi SC2GM089602.
Materials
| Product: | Catalog #: | Supplier: |
|---|---|---|
| DMI3000 Injection microscope | DMI3000 | Leica |
| Microinjector manipulator (Direct drive) | Narashige BC-3 Ball joint | Tritech Research |
| Needle Puller | Narashige PC-10 | Tritech Research |
| MicroInjector™ All-Digital Multi-pressure System | Narashige MINJ-D | Tritech Research |
| GeneElute™Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit | G1N70 | Sigma |
| pJet Cloning Jet kit | K1231 | Fermentas |
| GeneJET plasmid Miniprep kit | K0502 | Fermentas |
| DNA Clean & Concentrator™ | D4005 | ZYMO Research |
| BLOCK-IT™ RNAi TOPO® transcription kit | K3500-01 & K3650-01 | Invitrogen |
| Difco™Agar Noble | DF0142-15-2 | Fisher Scientifi |
| Microscope cover glass (1.5 – 0.16 to 0.19mm thick; Size: 50 x 45mm) | 12-554-F | Fisher Scientific |
| Glass capillaries (filament) | 615000 | A-M systems |
| Paraffin Oil (Heavy) | O122-1 | Fisher Scientific |
| KH2PO4 | P386-500 | Fisher Scientific |
| Na2HPO4 | AC20651-5000 | Fisher Scientific |
| NaCl | BP3581 | Fisher Scientific |
| MgSO4 | M80-500 | Fisher Scientific |
References
- Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Ahringer, J. Reverse Genetics. Wormbook. , (2006).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
- Junio, A. J., Li, X., Massery, H. C., Nolan, T. J., Lamitina, S. T., Sundaram, M. V., Lok, J. B. Strongyloides stercoralis: cell- and tissue-specific transgene expression and co-transformation with vector constructs incorporating a common multifunctional 3′ UTR. Exp. Parasitology. 118, 253-265 (2008).
- Schlager, B., Wang, X., Braach, G., Sommer, R. J. Molecular cloning of a dominant roller mutant and establishment of DNA-mediated transformation in the nematode Pristionchus pacificus. Genesis. 47, 300-304 (2009).
- Hong, R. L., Sommer, R. J. Pristionchus pacificus: a well-rounded nematode. Bioessays. 28, 651-659 (2006).
- Hong, R. L., Sommer, R. J. Chemoattraction in Pristionchus nematodes and implications for insect recognition. Curr. Biol. 16, 2359-2365 (2006).
- Rudel, D., Riebesell, M., Sommer, R. J. Gonadogenesis in Pristionchus pacificus and organ evolution: development, adult morphology and cell-cell interactions in the hermaphrodite gonad. Dev. Biol. 277, 200-221 (2005).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 11, 802-805 (1994).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis. J. Vis. Exp. (47), e2293-e2293 (2011).
- Evans, T. C. Transformation and Microinjection. Wormbook. , (2006).
