RNAi опосредованного Нокдаун гена и трансгенез по Микроинъекция в Necromenic нематода Pristionchus расШсиз</em
Summary
В модельных организмов, трансгенез может манипулировать функций генов в то время как РНК-интерференции может нокдаун конкретных стенограммы мРНК 1-2. Этот протокол направлен на иллюстрации методов, необходимое для внедрения стабильно передается ДНК и переходные двухцепочечной РНК в necromenic нематоды<em> Pristionchus расШсиз</em> Для исследований в эволюционной, развития и поведенческих биологии.
Abstract
Хотя это и более доступными для новых модельных организмов для получения полной последовательности генома, дальнейшего углубленного функции гена и выражения анализов, РНК-интерференция и стабильной трансгенез остается ограниченным во многих видов из-за особенности анатомии и молекулярной клеточной биологии организма. Например, за пределами Caenorhabditis корону группа, которая включает Caenorhabditis Элеганс 3, стабильно передается трансгенных линий, не связанных с Caenorhabditis видов не было зарегистрировано в этом благовидный типу (нематод), за исключением Strongyloides stercoralis 4 и Pristionchus расШсиз 5. Чтобы облегчить расширение роли П. расШсиз в изучении развития, эволюции и поведения 6-7, мы описываем здесь современные методы использовать микроинъекции для создания трансгенных животных и генной сбить путем РНК-интерференции. Как гонад <em> С. Элеганс и большинство других нематод, гонад P. расШсиз является syncitial и способных включения ДНК и РНК в ооцитах при доставке прямой микроинъекции. В отличие от С. Элеганс однако, стабильное наследование трансгенов и соматических выражение в П. расШсиз требует добавления собственной геномной ДНК переваривают эндонуклеазами дополнением к концам целевой трансгенов и инжекции маркеры 5. Кроме того носителя геномной ДНК похожа на требование для экспрессии трансгена в Strongyloides stercoralis 4 и в половых клетках C. Элеганс. Тем не менее, не ясно, если специальные требования для животных собственной геномной ДНК происходит потому, что П. расШсиз сома очень эффективно глушителей несложных мульти-копии генов или что внехромосомными массивы в P. расШсиз требуют геномных последовательностей для правильной сборки кинетохор во время митоза. Вентральной миграции двуруком (didelphic) гонад у гермафродитов еще более усложняет возможность вводить и половых желез в отдельных червей 8. Мы также демонстрируют использование микроинъекции в нокдаун доминирующим мутант (ролик, tu92) путем введения двухцепочечной РНК (дсРНК) в гонадах получить не-подвижного F 1 потомства. В отличие от С. Элеганс, но как и большинство других нематод, П. расШсиз PS312 не восприимчивы к системным RNAi через кормление и замачивания и, следовательно, дсРНК должны управлять микроинъекции в syncitial половых желез. В этом текущем исследовании, мы надеемся, чтобы описать процесс микроинъекции, необходимых для преобразования PPA-EGL-4 промоутера:: GFP репортер слияния и нокдаун доминирующим ролик ПРЛ-1 (tu92) мутант в визуально информативные протокола.
Protocol
Discussion
П. расШсиз населения находятся в тесной связи с различными скарабей видов по всему миру и представляет собой модель нематоды промежуточным между свободными и паразитических нематод. Сила П. расШсиз в качестве новой модели организма заключается в интеграции ее генетические и…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы очень благодарны RJ Соммер и X Ван за помощью микроинъекции, а также проницательные комментарии от анонимных рецензентов. Эта работа проводится при поддержке гранта NIH SC2GM089602.
Materials
| Product: | Catalog #: | Supplier: |
|---|---|---|
| DMI3000 Injection microscope | DMI3000 | Leica |
| Microinjector manipulator (Direct drive) | Narashige BC-3 Ball joint | Tritech Research |
| Needle Puller | Narashige PC-10 | Tritech Research |
| MicroInjector™ All-Digital Multi-pressure System | Narashige MINJ-D | Tritech Research |
| GeneElute™Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit | G1N70 | Sigma |
| pJet Cloning Jet kit | K1231 | Fermentas |
| GeneJET plasmid Miniprep kit | K0502 | Fermentas |
| DNA Clean & Concentrator™ | D4005 | ZYMO Research |
| BLOCK-IT™ RNAi TOPO® transcription kit | K3500-01 & K3650-01 | Invitrogen |
| Difco™Agar Noble | DF0142-15-2 | Fisher Scientifi |
| Microscope cover glass (1.5 – 0.16 to 0.19mm thick; Size: 50 x 45mm) | 12-554-F | Fisher Scientific |
| Glass capillaries (filament) | 615000 | A-M systems |
| Paraffin Oil (Heavy) | O122-1 | Fisher Scientific |
| KH2PO4 | P386-500 | Fisher Scientific |
| Na2HPO4 | AC20651-5000 | Fisher Scientific |
| NaCl | BP3581 | Fisher Scientific |
| MgSO4 | M80-500 | Fisher Scientific |
References
- Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Ahringer, J. Reverse Genetics. Wormbook. , (2006).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
- Junio, A. J., Li, X., Massery, H. C., Nolan, T. J., Lamitina, S. T., Sundaram, M. V., Lok, J. B. Strongyloides stercoralis: cell- and tissue-specific transgene expression and co-transformation with vector constructs incorporating a common multifunctional 3′ UTR. Exp. Parasitology. 118, 253-265 (2008).
- Schlager, B., Wang, X., Braach, G., Sommer, R. J. Molecular cloning of a dominant roller mutant and establishment of DNA-mediated transformation in the nematode Pristionchus pacificus. Genesis. 47, 300-304 (2009).
- Hong, R. L., Sommer, R. J. Pristionchus pacificus: a well-rounded nematode. Bioessays. 28, 651-659 (2006).
- Hong, R. L., Sommer, R. J. Chemoattraction in Pristionchus nematodes and implications for insect recognition. Curr. Biol. 16, 2359-2365 (2006).
- Rudel, D., Riebesell, M., Sommer, R. J. Gonadogenesis in Pristionchus pacificus and organ evolution: development, adult morphology and cell-cell interactions in the hermaphrodite gonad. Dev. Biol. 277, 200-221 (2005).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 11, 802-805 (1994).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis. J. Vis. Exp. (47), e2293-e2293 (2011).
- Evans, T. C. Transformation and Microinjection. Wormbook. , (2006).
