RNAiは、Necromenic虫にマイクロインジェクションによる遺伝子ノックダウンとトランスジェネシスを媒介 Pristionchus pacificus</em
Summary
RNAiは、特定のmRNAの転写産物が1〜2ノックダウンできますが、モデル生物において、遺伝子導入は遺伝子の機能を操作することができます。このプロトコルは、necromenic線虫に安定的に伝送されるDNAと一時的な二本鎖RNAを導入するために必要な手法を例示することを目指して<em> Pristionchus pacificus</em>、進化の発達、および行動生物学の研究のため。
Abstract
それは、RNA干渉と安定した遺伝子導入による遺伝子機能と発現解析-深さで、さらに、完全に配列のゲノムを取得し、特定の解剖学と生物の分子細胞生物学のために多くの種に限られている。ために新たなモデル生物にとってますます手頃な価格ですが、例えば、 線虫（Caenorhabditis elegans）3を含むクラウングループの線虫の外で、非線虫種で安定的に伝送されるトランスジェニック系統は、 糞線虫 4とPristionchus pacificus 5の例外を除いて、このもっともらしい門（線虫）で報告されていない。 P.の拡大する役割を容易に開発、進化、そして行動6-7の研究ではpacificusは 、我々はここにトランスジェニック動物や遺伝子のRNAiによるノックダウンを行うためのマイクロインジェクションを使用する現在の方法を説明します。の生殖腺のような<em> C.虫や他のほとんどの線虫、P.の生殖腺pacificusは syncitialと直接マイクロインジェクションによって提供される卵母細胞にDNAとRNAを組み込むことが可能です。 C.とは異なり、 P.の虫はしかし、安定した導入遺伝子の継承と身体表現pacificusは、ターゲットの導入遺伝子と共射出マーカー5の両端に相補的なエンドヌクレアーゼで消化し 、自己ゲノムDNAを追加する必要があります。キャリアのゲノムDNAの添加は、 糞線虫 4とCの生殖細胞における遺伝子発現のための要件と同様ですエレガンス 。動物の独自のゲノムDNAの特定の要件がある場合は、それが明らかでないため、P. pacificus相馬は非複雑なマルチコピー遺伝子またはP.でその染色体外配列を黙らせるには非常に効率的です。 pacificusは、有糸分裂時の適切な動原体のアセンブリのためのゲノム配列が必要です。二軍の腹の移行（二子宮の）雌雄同体の生殖腺では、さらに個々のワーム8の両方の生殖腺を注入する能力を複雑にしています。我々はまた、ノックダウン、非ローリングF 1子孫を得るために生殖腺に二本鎖RNA（dsRNA）を注入することにより、優性突然変異体を（ローラー、tu92）にマイクロインジェクションの使用方法を示しています。 C.とは異なり、 虫 、他のほとんどの線虫のように、P. pacificus PS312は、餌と浸すため、dsRNAをsyncitial生殖巣にマイクロインジェクションによって投与されている必要がありますを介して全身性のRNAiを受け入れるではありません。この現在の研究では、PPA – EGL – 4プロモーターを変換するために必要なマイクロインジェクションのプロセスを記述することを望む：：GFP融合レポーターとノックダウン支配的なローラーPRL – 1（tu92）視覚的に有益なプロトコルの変異体。
Protocol
Discussion
P. pacificusの集団は、世界の様々なコガネムシの種と密接に関連して発見し、自由生活と寄生線虫の中間のモデル線虫であるされています。 P.の強さ新興モデル生物としてpacificus、公正な前進遺伝子スクリーニング（ すなわちだけでなく、以前にC.エレガンスを特徴とする候補遺伝子のための）6,10から分離された変異体の位置的なマッピングを促進し…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、マイクロインジェクション、だけでなく、匿名のレビュアーからの洞察に満ちたコメントで支援するためのRJサマー＆X王に非常に感謝しています。この作品は、NIHの助成金SC2GM089602によってサポートされています。
Materials
| Product: | Catalog #: | Supplier: |
|---|---|---|
| DMI3000 Injection microscope | DMI3000 | Leica |
| Microinjector manipulator (Direct drive) | Narashige BC-3 Ball joint | Tritech Research |
| Needle Puller | Narashige PC-10 | Tritech Research |
| MicroInjector™ All-Digital Multi-pressure System | Narashige MINJ-D | Tritech Research |
| GeneElute™Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit | G1N70 | Sigma |
| pJet Cloning Jet kit | K1231 | Fermentas |
| GeneJET plasmid Miniprep kit | K0502 | Fermentas |
| DNA Clean & Concentrator™ | D4005 | ZYMO Research |
| BLOCK-IT™ RNAi TOPO® transcription kit | K3500-01 & K3650-01 | Invitrogen |
| Difco™Agar Noble | DF0142-15-2 | Fisher Scientifi |
| Microscope cover glass (1.5 – 0.16 to 0.19mm thick; Size: 50 x 45mm) | 12-554-F | Fisher Scientific |
| Glass capillaries (filament) | 615000 | A-M systems |
| Paraffin Oil (Heavy) | O122-1 | Fisher Scientific |
| KH2PO4 | P386-500 | Fisher Scientific |
| Na2HPO4 | AC20651-5000 | Fisher Scientific |
| NaCl | BP3581 | Fisher Scientific |
| MgSO4 | M80-500 | Fisher Scientific |
References
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