RNAi מתווכת מציאה ין Transgenesis ידי Microinjection ב נמטודות Necromenic Pristionchus פקיפיקוס</em
Summary
ב אורגניזמים מודל, transgenesis יכול לתפעל פונקציות גן בעוד RNAi יכול מציאה תעתיקי mRNA ספציפי 1-2. פרוטוקול זה נועד להמחיש את טכניקות צורך להציג DNA מועבר ביציבות וחולפת RNA גדילי כפול לתוך נמטודות necromenic<em> Pristionchus פקיפיקוס</em> ללימודי הביולוגיה האבולוציונית, התפתחותיים, התנהגותיים.
Abstract
למרות זאת הוא סביר יותר ויותר עבור אורגניזמים מודל המתעוררים להשיג רצף הגנום לחלוטין, נוסף מעמיק פונקציה גן ומנתח ביטוי על ידי התערבות RNA ו transgenesis יציב להישאר מוגבלת מינים רבים בשל האנטומיה בפרט ביולוגיה תאית מולקולרית של האורגניזם. כך, למשל, מחוץ Caenorhabditis קבוצת כתר הכולל Caenorhabditis elegans 3, המשודר ביציבות קווי מהונדס שאינם Caenorhabditis מינים לא דווחו מערכה זו מטעה (Nematoda), למעט Strongyloides stercoralis 4 ו Pristionchus פקיפיקוס 5. כדי להקל את תפקידו המתרחב של פ פקיפיקוס במחקר של התפתחות, אבולוציה, התנהגות 6-7, נתאר כאן את השיטות הקיימות להשתמש microinjection להכנת חיות טרנסגניות ואת הגן להפיל על ידי RNAi. כמו בלוטות המין של <em> ג elegans ורוב נמטודות אחרים, בלוטות המין של פ פקיפיקוס הוא syncitial ומסוגלים שילוב DNA ו-RNA לתוך ביציות כאשר נמסר על ידי microinjection ישיר. שלא כמו ג elegans עם זאת, transgene ירושה יציבה ביטוי סומטי פ פקיפיקוס דורש תוספת של הדנ"א הגנומי עצמי מעוכל עם endonucleases משלים את הקצוות של transgenes היעד סמנים coinjection 5. תוספת של הדנ"א הגנומי הספק דומה הדרישה לביטוי transgene ב Strongyloides stercoralis 4 והן בתאי הנבט של C. elegans. עם זאת, לא ברור אם דרישה ספציפית של הדנ"א הגנומי שלו של החיות הוא כי פ פקיפיקוס סומה הוא יעיל מאוד השתקת שאינם מורכבים רב להעתיק את הגנים או מערכים extrachromosomal ב P. פקיפיקוס דורשים רצף גנומי להרכבה kinetochore נאות במהלך מיטוזה. ההגירה הגחון של שני חמושים (didelphic) בלוטות המין של הרמפרודיטים מסבכת עוד יותר את היכולת להזריק הן בלוטות המין של תולעים הפרט 8. אנחנו גם מדגימים את השימוש microinjection כדי מציאה מוטציה דומיננטית (הרים, tu92) על ידי הזרקת פעמיים תקועים RNA (dsRNA) לתוך בלוטות המין כדי להשיג ללא גלגול 1 הצאצאים F. שלא כמו ג elegans, אבל כמו נמטודות האחרים, פ ' פקיפיקוס PS312 אינו פתוח RNAi מערכתי באמצעות האכלה השריית ולכן dsRNA חייב להיות מנוהל על ידי microinjection לתוך בלוטות המין syncitial. במחקר הנוכחי, אנו מקווים לתאר את התהליך microinjection צורך להפוך האמרגן PPA-EGL-4:: כתב ה-GFP היתוך מציאה הרים דומיננטי PRL-1 (tu92) מוטציה בפרוטוקול מידע חזותי.
Protocol
Discussion
פ אוכלוסיות פקיפיקוס נמצאים בשיתוף הדוק עם מינים שונים חיפושית חיפושית ברחבי העולם הוא נמטודות מודל ביניים בין חיים חופשיים נמטודות טפיליות. כוחה של פ פקיפיקוס כאורגניזם מודל המתעוררים טמון בשילוב של מפות גנטיות הפיזי שלה כי לקדם מיפוי מיקומית של מוט…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים מאוד RJ זומר ו-X וואנג לסיוע עם microinjection, כמו גם הערות תובנה מן הבודקים אנונימי. עבודה זו נתמכת על ידי NIH מענק SC2GM089602.
Materials
| Product: | Catalog #: | Supplier: |
|---|---|---|
| DMI3000 Injection microscope | DMI3000 | Leica |
| Microinjector manipulator (Direct drive) | Narashige BC-3 Ball joint | Tritech Research |
| Needle Puller | Narashige PC-10 | Tritech Research |
| MicroInjector™ All-Digital Multi-pressure System | Narashige MINJ-D | Tritech Research |
| GeneElute™Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit | G1N70 | Sigma |
| pJet Cloning Jet kit | K1231 | Fermentas |
| GeneJET plasmid Miniprep kit | K0502 | Fermentas |
| DNA Clean & Concentrator™ | D4005 | ZYMO Research |
| BLOCK-IT™ RNAi TOPO® transcription kit | K3500-01 & K3650-01 | Invitrogen |
| Difco™Agar Noble | DF0142-15-2 | Fisher Scientifi |
| Microscope cover glass (1.5 – 0.16 to 0.19mm thick; Size: 50 x 45mm) | 12-554-F | Fisher Scientific |
| Glass capillaries (filament) | 615000 | A-M systems |
| Paraffin Oil (Heavy) | O122-1 | Fisher Scientific |
| KH2PO4 | P386-500 | Fisher Scientific |
| Na2HPO4 | AC20651-5000 | Fisher Scientific |
| NaCl | BP3581 | Fisher Scientific |
| MgSO4 | M80-500 | Fisher Scientific |
References
- Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Ahringer, J. Reverse Genetics. Wormbook. , (2006).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
- Junio, A. J., Li, X., Massery, H. C., Nolan, T. J., Lamitina, S. T., Sundaram, M. V., Lok, J. B. Strongyloides stercoralis: cell- and tissue-specific transgene expression and co-transformation with vector constructs incorporating a common multifunctional 3′ UTR. Exp. Parasitology. 118, 253-265 (2008).
- Schlager, B., Wang, X., Braach, G., Sommer, R. J. Molecular cloning of a dominant roller mutant and establishment of DNA-mediated transformation in the nematode Pristionchus pacificus. Genesis. 47, 300-304 (2009).
- Hong, R. L., Sommer, R. J. Pristionchus pacificus: a well-rounded nematode. Bioessays. 28, 651-659 (2006).
- Hong, R. L., Sommer, R. J. Chemoattraction in Pristionchus nematodes and implications for insect recognition. Curr. Biol. 16, 2359-2365 (2006).
- Rudel, D., Riebesell, M., Sommer, R. J. Gonadogenesis in Pristionchus pacificus and organ evolution: development, adult morphology and cell-cell interactions in the hermaphrodite gonad. Dev. Biol. 277, 200-221 (2005).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 11, 802-805 (1994).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis. J. Vis. Exp. (47), e2293-e2293 (2011).
- Evans, T. C. Transformation and Microinjection. Wormbook. , (2006).
