Produktion und Nachweis von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Cancers
Summary
Hier schlagen wir einfache Methoden zu testen und auszuwerten Anwesenheit von reaktiven Sauerstoffspezies in den Zellen.
Abstract
Reaktive Sauerstoffspezies sind eine Reihe von Molekülen, die Schäden von DNA und RNA und oxidieren Proteine und Lipide (Lipid peroxydation). Diese reaktiven Moleküle enthalten eine Sauerstoff und sind H 2 O 2 (Wasserstoffperoxid), NO (Stickstoffmonoxid), O 2 – (Oxid-Anionen), Peroxynitrit (ONOO -), hydrochlorous Säure (HOCl) und Hydroxyl-Radikal (OH -) .
Oxidativer Arten sind nicht nur unter pathologischen Situationen (Krebs, ischämischer / Reperfusion, neurologischen und Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Infektionskrankheiten, Entzündungskrankheiten 1, Autoimmunerkrankungen 2, etc …), sondern auch während der physiologische (nicht krankhafte) Situationen wie Zellstoffwechsel 3 hergestellt , 4. In der Tat spielen ROS eine wichtige Rolle in vielen zellulären Signalwege (Proliferation, Zell-Aktivierung 5, 6, 7 etc. Migration.). ROS können schädlich sein (es wird dann bezeichnet als"Oxidativen Stress und nitrosative"), wenn in großen Mengen in den intrazellulären Kompartimenten und Zellen produziert allgemein ROS reagieren heraufregulierende Antioxidantien wie Superoxid-Dismutase (SOD) und Katalase (CAT), Glutathionperoxidase (GPx) und Glutathion (GSH), das schützt sie durch die Umwandlung gefährlichen freien Radikale in unschädliche Moleküle (zB Wasser). Vitamine C und E sind auch als ROS-Fänger (Antioxidantien) beschrieben worden.
Freie Radikale sind vorteilhaft in niedrigen beträgt 3. Makrophagen und neutrophilen Granulozyten-vermittelte Immunantwort beinhalten die Produktion und Freisetzung von NO, die Viren, Krankheitserreger und Tumorproliferation 8 hemmt. NO reagiert auch mit anderen ROS und somit hat auch eine Rolle als detoxifier (ROS Scavenger). Schließlich NO wirkt auf Schiffen, um den Blutfluss, die wichtig für die Anpassung der Muskel längere Übung 9, 10 zu regulieren. Mehrere Veröffentlichungen haben auch gezeigt, dass ROS in Insulin-sens beteiligt sinditivity 11, 12.
Zahlreiche Methoden zur ROS-Produktion zu bewerten sind. In diesem Artikel schlagen wir mehrere einfache, schnelle und kostengünstige Assays; diese Tests wurden von zahlreichen Publikationen validiert und werden routinemäßig verwendet werden, um ROS oder ihre Auswirkungen in Säugetierzellen zu erkennen. Während einige dieser Tests mehrere ROS erkennen, erkennen andere nur ein einziges ROS.
Protocol
Discussion
Mehrere pathologischen Situationen wie entzündlichen Erkrankungen, Krebs, Ischämie / Reperfusion und auch Behandlungen wie Bestrahlung oder Chemotherapie (dh Cisplatin) induzieren ROS Überproduktion. So erkennen und zu messen ROS Ebenen ist in vielen grundlegenden, präklinischen und klinischen Studien wichtig. Allerdings haben ROS sehr kurze Halbwertszeiten und könnte kompliziert zu erkennen. Hier schlagen wir vor, einfache Tests, die routinemäßig verwendet werden, und weithin akzeptierte für den Nachweis von Pr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health (CA142664) unterstützt.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| 5-(and-6)-carboxy-2′,7′-dichlorofluorescein diacetate (carboxy-DCFDA) | Molecular Probes | C369 | control |
| carboxy-H2DCFDA | Molecular Probes | C400 | |
| Sulfanilamide | Sigma | S9251-100G | |
| N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride | Sigma | N9125-10G | |
| Nitrite standard | Sigma | 237213-100G | |
| GSH/GSSG-Glo Assay | Promega | V6612 | To quantify oxidized, reduced or oxidized/reduced glutathione |
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