הפקה וזיהוי של מינים חמצן תגובתי (ROS) סרטן
Summary
כאן אנו מציעים שיטות פשוטות כדי לבחון ולהעריך את הנוכחות של מינים חמצן תגובתי בתאים.
Abstract
מינים החמצן מגיב לכלול מספר מולקולות DNA ו-RNA נזק ו לחמצן חלבונים ושומנים (peroxydation שומנים בדם). אלה מכילים מולקולות חמצן כוללים H 2 O 2 (מי חמצן), NO (תחמוצת החנקן), O 2 – (אניון תחמוצת), peroxynitrite (ONOO -), חומצה hydrochlorous (HOCl), ו רדיקלי הידרוקסיל (OH -) .
מינים חמצוני מיוצרים לא רק תחת מצבים פתולוגיים (סרטן, reperfusion איסכמי /, מחלות נוירולוגיות לב וכלי דם, מחלות זיהומיות, מחלות דלקתיות 1, מחלות אוטואימוניות 2, וכו …) אלא גם במצבים פיזיולוגיים (לא פתולוגי) כגון חילוף החומרים התאי 3 , 4. ואכן, ROS ממלאים תפקידים חשובים רבים מסלולי איתות תאיים (התפשטות, הפעלת תא 5, 6, 7 הגירה וכו '.). ROS יכול להיות מזיק (זה נקרא אז בשם"סטרס חמצוני nitrosative") כאשר מיוצר בכמויות גבוהות של תאים תאים תאיים בדרך כלל להגיב על ידי ROS upregulating נוגדי חמצון כגון superoxide dismutase (SOD) ו Catalase (CAT), peroxidase גלוטתיון (GPX) ו גלוטתיון (GSH) המגן אותם רדיקלים חופשיים על ידי המרת מסוכן מולקולות מזיקות (כלומר מים). ויטמינים C ו-E יש גם כמתואר נבלות ROS (נוגדי חמצון).
רדיקלים חופשיים הם מועילים סכומים נמוכים 3. Macrophage ו נויטרופילים בתיווך תגובות חיסוניות לערב את ייצור שחרור NO, אשר מעכב וירוסים, פתוגנים התפשטות הגידול 8. NO גם מגיב עם ROS אחרים ולכן, יש גם תפקיד כמו detoxifier (נבלות ROS). לבסוף NO פועלת על כלי לווסת את זרימת הדם שהינה חשובה ההסתגלות של השריר לממש ממושכת 9, 10. פרסומים אחדים הראו גם כי ROS מעורבים Sens אינסוליןitivity 11, 12.
שיטות רבות להעריך ייצור ROS זמינים. במאמר זה אנו מציעים מבחני פשוט, מהיר, וזול מספר: מבחני הללו אומתו על ידי פרסומים רבים משמשים באופן שגרתי כדי לזהות ROS או השפעותיו בתאי יונקים. בעוד שחלק מבחני אלה לזהות ROS מרובים, אחרים לזהות רק ROS יחיד.
Protocol
Discussion
במצבים פתולוגיים אחדים כגון מחלות, סרטן דלקתיות, איסכמיה / reperfusion, גם טיפולים כגון קרינה או כימותרפיה (ציספלטין למשל) לעורר ייצור יתר ROS. לפיכך, גילוי מדידת רמות ROS חשוב רבים, מחקרים בסיסיים טרום קליניים וקליניים. עם זאת, ROS יש מחצית חיים קצר מאוד יכול להיות מסובך לזהות. כ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (CA142664).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| 5-(and-6)-carboxy-2′,7′-dichlorofluorescein diacetate (carboxy-DCFDA) | Molecular Probes | C369 | control |
| carboxy-H2DCFDA | Molecular Probes | C400 | |
| Sulfanilamide | Sigma | S9251-100G | |
| N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride | Sigma | N9125-10G | |
| Nitrite standard | Sigma | 237213-100G | |
| GSH/GSSG-Glo Assay | Promega | V6612 | To quantify oxidized, reduced or oxidized/reduced glutathione |
References
- Guzik, T. J., Korbut, R., Adamek-Guzik, T. Nitric oxide and superoxide in inflammation and immune regulation. J Physiol Pharmacol. 54, 469-487 (2003).
- Perl, A., Gergely, P., Banki, K. Mitochondrial dysfunction in T cells of patients with systemic lupus erythematosus. Int Rev Immunol. 23, 293-313 (2004).
- Valko, M., Leibfritz, D., Moncol, J., Cronin, M. T., Mazur, M., Telser, J. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Int J Biochem Cell Biol. 39, 44-84 (2007).
- Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol Rev. 82, 47-95 (2002).
- Nakamura, K., Yube, K., Miyatake, A., Cambier, J. C., Hirashima, M. Involvement of CD4 D3-D4 membrane proximal extracellular domain for the inhibitory effect of oxidative stress on activation-induced CD4 down-regulation and its possible role for T cell activation. Mol Immunol. 39, 909-921 (2003).
- Los, M., Droge, W., Stricker, K., Baeuerle, P. A., Schulze-Osthoff, K. Hydrogen peroxide as a potent activator of T lymphocyte functions. Eur J Immunol. 25, 159-165 (1995).
- Deem, T. L., Cook-Mills, J. M. Vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1) activation of endothelial cell matrix metalloproteinases: role of reactive oxygen species. Blood. 104, 2385-2393 (2004).
- Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease. Physiol Rev. 87, 315-424 (2007).
- Griendling, K. K., Sorescu, D., Lassegue, B., Ushio-Fukai, M. Modulation of protein kinase activity and gene expression by reactive oxygen species and their role in vascular physiology and pathophysiology. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 2175-2183 (2000).
- Loh, K., Deng, H., Fukushima, A., Cai, X., Boivin, B., Galic, S., Bruce, C., Shields, B. J., Skiba, B., Ooms, L. M., Stepto, N., Wu, B., Mitchell, C. A., Tonks, N. K., Watt, M. J., Febbraio, M. A., Crack, P. J., Andrikopoulos, S., Tiganis, T. Reactive oxygen species enhance insulin sensitivity. Cell Metab. 10, 260-272 (2009).
- Goldstein, B. J., Mahadev, K., Wu, X. Redox paradox: insulin action is facilitated by insulin-stimulated reactive oxygen species with multiple potential signaling targets. Diabetes. 54, 311-321 (2005).
