Summary
Un nouveau protocole pour la préparation mécanique des suspensions de cellules testiculaires de matériel de rongeurs, en évitant les enzymes et les détergents, est décrite. La méthode est très simple, rapide et reproductible, et rend les suspensions cellulaires de bonne qualité, qui sont adaptés pour le tri de flux et extraction de l'ARN.
Abstract
Testicules de mammifères sont des organes très complexes qui contiennent plus de 30 différents types de cellules, notamment les cellules testiculaires somatiques et les différentes étapes de cellules germinales. Cette hétérogénéité est un inconvénient majeur en ce qui concerne l'étude des bases de la spermatogenèse chez les mammifères, comme les populations de cellules pures ou enrichies dans certaines étapes du développement des spermatozoïdes sont nécessaires pour la plupart des analyses moléculaires 1.
Diverses stratégies telles que Staput 2,3, élutriation centrifuge 1, et cytométrie de flux (FC) 4,5 ont été utilisées pour obtenir des populations de cellules testiculaires enrichi ou purifié afin de permettre des études d'expression différentielle de gènes.
Il est nécessaire que les cellules sont en suspension de la plupart des approches d'enrichissement / purification. Idéalement, la suspension cellulaire sera représentatif du tissu d'origine, une forte proportion de cellules viables et peu multinucleates - qui ont tendance à se former en raison de lasyncytial nature de l'épithélium séminifère 6,7 - et amas de cellules manquent de 1. Les rapports précédents ont mis en évidence que des suspensions de cellules testiculaires préparés par un procédé exclusivement mécanique agglutinées plus facilement que ceux trypsinisés 1. D'autre part, les traitements enzymatiques avec RNAses et / ou des enzymes désagrégation comme la trypsine et la collagénase conduit à la dégradation des macromolécules spécifique, ce qui n'est pas souhaitable pour certaines applications en aval. Le processus idéal doit être aussi courte que possible et impliquer une manipulation minimale, afin de parvenir à une bonne conservation des macromolécules d'intérêt tels que les ARNm. Les protocoles actuels pour la préparation des suspensions cellulaires de tissus solides sont généralement beaucoup de temps, très dépendante de l'opérateur, et peut endommager de façon sélective certains types de cellules 1,8.
Le protocole présenté ici combine les avantages d'une ventilation mécanique hautement reproductible et extrêmement brève avec l'unBSENCE de traitement enzymatique, ce qui conduit à des suspensions cellulaires de bonne qualité qui peuvent être utilisés pour l'analyse de cytométrie de flux et tri 4, et les études d'expression génique pensées 9.
Protocol
1. Préparation des suspensions cellulaires
- Sacrifiez le spécimen à être utilisés suivant les recommandations des comités spécialisés tels que IACUC ou équivalent (en Uruguay, Commission nationale pour l'expérimentation animale [CNEA]). Dans notre cas, une surdose de pentobarbital a été administré.
- Disséquer les testicules en suivant les procédures normales approuvées et les placer dans un verre 96 mm boîte de Pétri sur la glace, contenant 10 ml de DMEM glacée complété avec 10% de sérum de veau foetal.
- Retirez la tunique albuginée et couper les testicules décapsulés en morceaux carrés de 2 - 3 mm de chaque côté.
- Ces pièces sont ensuite traitées dans un Medimachine, un broyeur mécanique automatisé où le tissu est ventilé à l'intérieur d'un appareil jetable contenant un écran en acier inoxydable perforé et un rotor en métal. Pour ce faire, placer 1 ml de DMEM complété froid et 4-5 de ces pièces dans une unité de 50 um jetable, allumez le disaggregator et processus pendant 50 s suivant les instructions simples du fabricant.
- Récupérer la suspension cellulaire obtenue à partir de l'unité de ventilation à l'aide d'une 3-5 ml seringue sans aiguille.
- Filtrer à travers un maillage de 50 um nylon, préalablement trempée avec 0,5 ml de DMEM complété.
- Filtrer la suspension à nouveau en utilisant une imbibé 25 um filet de nylon, et le placer sur la glace.
- Comptez dans une chambre Neubauer et ajuster la concentration cellulaire à 1 - 2 x 10 7 cellules / ml avec DMEM complété. Au moins 4 x 10 7 cellules / gramme de matière testicules sont généralement obtenus.
- Enfin, ajouter NDA (2-naphtol-6 ,8-disulfonique, sel dipotassique) à une concentration finale de 0,2% afin d'empêcher l'agglutination des cellules.
- En option: vérifier la viabilité cellulaire des suspensions cellulaires testiculaires avec un kit de viabilité disponible dans le commerce pour les cellules animales, en suivant les instructions du fabricant.
2. Flux cytométrie
ve_content "> Nous avons utilisé une Becton-Dickinson FACSVantage cytomètre de flux équipé d'un laser à ions argon cohérent accordé à émettre à 488 nm pour l'analyse des cellules colorées avec de fortes concentrations d'iodure de propidium (PI). (La question de la PI entrée en non fixée cellules sous contrainte a été abordée ailleurs 9,10).- Pour PI coloration, ajouter fluorochrome à une concentration finale de 50 pg / ml de la suspension cellulaire, et incuber pendant 10 min à 0 ° C dans l'obscurité.
- Puissance du laser est fixée à 100 mW et un filtre passe-575/26 bande est utilisée pour recueillir PI-fluorescence émise en LV2.
- Nous effectuons des mesures FC avec une buse de 70 um. Pour trier les populations spermatocytes, réglez le mode de tri en mode Normal-R ou Normal-C, en utilisant 3 gouttes triés comme enveloppe. Garder l'échantillon et les tubes de collecte à 3 - 4 ° C en utilisant une unité de réfrigération. Ajuster différentiel de l'échantillon à analyser des cellules à une vitesse de 500 à 1 500 par seconde.
- Utilisez un logiciel CellQuest (BD) pour analyserles paramètres suivants: diffusion vers l'avant (FSC-H); diffusion latérale (SSC-H); fluorescence émise totale ou pulse-zone (FL2-A), et la durée de l'émission de fluorescence ou de largeur d'impulsion (FL2-W).
Sinon, nous avons utilisé le colorant vital Hoechst 33342 à une concentration finale de 5 pg / ml et incubé pendant 10 min à 37 ° C dans l'obscurité. l'analyse des cellules a été effectuée au moyen d'un cytomètre MoFlo (Dakocytomation) équipés d'une excitation UV de longueur d'onde laser fonctionnant à 25 mW et en utilisant une buse de 70 um. Manipulation des données a été réalisée avec le logiciel Summit v4.3 (DakoCytomation).
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Representative Results
Un exemple d'une suspension de cellules bien ventilées à partir de testicules de rats préparés avec le protocole décrit ici est illustré à la figure 1.
En comparaison avec les traitements enzymatiques 6,8 et à des méthodes de désagrégation mécanique décrit précédemment 2, celui présenté ici est beaucoup plus rapide, nécessite moins de manipulation, est facilement reproductible (non opérateur-dépendant), et rend les débris de cellules rares (surtout par rapport à d'autres méthodes mécaniques méthodes) et très peu multinucleates (qui ont été décrites pour former comme une conséquence de la manipulation des tissus vaste 1,2). En outre, contrairement aux traitements enzymatiques, il évite l'utilisation de RNAses, la trypsine et la collagénase, qui pourrait favoriser la dégradation des macromolécules.
D'autre part, bien que les rapports précédents avaient mis en évidence que des suspensions de cellules testiculaires préparés par un procédé exclusivement mécanique agglutinées plus facilement que sur trypsiniséees 1, l'application de la méthode actuelle a rendu très peu agglutination dans les suspensions cellulaires, comme on peut le voir sur la figure 1. En ce sens, nous avons trouvé l'inclusion de NDA très efficace dans la prévention de l'agglutination des cellules, et en évitant l'obstruction des buses pendant les études de flux ultérieurs. Figure 1 révèle également la rareté des débris cellulaires, ce qui est aussi évident dans les histogrammes FC représentés dans la figure 2.
Par ailleurs, les suspensions cellulaires préparées avec cette méthode montrent une représentation adéquate des différents types de cellules testiculaires. Cela a été conclu en comparant la composition cellulaire de suspensions cellulaires testiculaires préparés par la méthode présentée ici avec les données déclarées de la numération des cellules dans des sections de tubes séminifères, et avec des suspensions cellulaires préparés en utilisant d'autres méthodes ainsi (tableau 1).
FC histogrammes obtenus pour les suspensions préparées par la preseprotocole nt et colorées soit avec Hoechst 33342 (figure 2A) ou PI (figure 2B) ne diffèrent pas sensiblement de ceux présentés précédemment 8, soutenant également l'hypothèse selon laquelle la procédure ne porte pas atteinte de manière sélective n'importe quel type de cellule spécifique.
| Types de cellules testiculaires basé sur la teneur en ADN | Testicules Intact a (%) | Suspensions préparées B (%) - Medimachine | Suspensions trypsinisés une (%) |
| A) Mus musculus | |||
| C | 66,2 | 62,5 | 79,6 |
| 2C | 16.4 | 18.4 | 7.3 |
| 4C </ Td> | 17.9 | 18,7 | 8.7 |
| Autres | - | - | 4.6 |
| B) Cavia porcellus | |||
| C | 66,5 | 65,5 | N / D |
| 2C | 11.0 | 11,5 | N / D |
| 4C | 22.5 | 23.0 | N / D |
| Une cellule comptages ont été évaluées par l'observation microscopique. b numérations cellulaires ont été évalués par cytométrie de flux. | |||
Tableau 1. Pourcentages relatifs des populations de cellules testiculaires adultes diffèrent par leur contenu en ADN des suspensions cellulaires de souris (A) et la Guinée porc (B) préparé par la méthode présentée par la présente, par rapport aux testicules intacts et - pour souris - to suspensions trypsine préparés (modifié de Geisinger et Rodríguez-Casuriaga, Cytogenet. Genome Res. 128, 46 (2010)). contenu d'ADN sont: C (spermatides rondes et élongation, les spermatozoïdes), 2C (cellules somatiques testiculaires, les spermatogonies, spermatocytes secondaires) et 4C (spermatocytes primaires et une prolifération des spermatogonies peu stade G2).
Figure 1. Vue partielle d'une suspension de cellules de testicules de rats adultes préparés par le présent Protocole et visualisées par microscopie à contraste de phase. Comme on peut le voir, cytoplasme des cellules sont bien conservés. La barre correspond à 25 um. Reproduit de Rodríguez-Casuriaga, et al., Biol. Proced. Online. 11, 184 (2009).
Figure 2. FC ADN analyse du contenu des suspensions de cellules testiculaires de rats adultes, les souris, les cochons d'Inde et de 21 jours du post-partum (DPP) de ratons, colorées avec le colorant vital Hoechst 33342 (A) ou avec PI (B). Dans tous les cas populations de cellules C, 2C et 4C peuvent être facilement décrits dans les histogrammes obtenus avec les deux colorants, ainsi que le pic semble sous-haploïde à la gauche de la population C. Ce dernier pic a été démontré pour contenir les spermatozoïdes, qui apparaissent comme une sous-population de moins teinté séparé en raison de leur état de chromatine condensée 12. Notez la rareté des débris dans tous les graphiques. Cela est particulièrement évident dans le 21 DPP (juvéniles) profils, qui manquent spermatides et les spermatozoïdes. Modifié à partir de Geisinger et Rodríguez-Casuriaga, Cytogenet. Res génome. 128, 46 (2010). Cliquez ici pour agrandir la figure.
Figure 3. Population de cellules 4C triée à partir d'une suspension de cellules testiculaires de rats adultes. Cellules triées ont été déposés sur des lames-lysine-traités poly L propres et observée au microscope à contraste de phase (A) ou d'un champ lumineux après coloration Giemsa (B). Bar = 20 um. Reproduit de Geisinger et Rodríguez-Casuriaga, Cytogenet. Res génome. 128, 46 (2010).
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. Figure 4 A) FC analyse d'une suspension adulte Guinée de porc testiculaire cellulaire préparé avec le protocole décrit ici (a), histogramme;. (B), en points. Notez que les deux sous-populations de la population de cellules 4C. B) Analyse des cellules triées de la 4C R3 (a, b) et R4 (a ', b') régions. (A, a '), des images de microscope à épifluorescence de cellules PI-tachés . Notez que les noyaux de la région R3 sont comparativement plus faible. Bar: 10 pm (b, b '), Laser microscopie confocale de réactions immunocytochimiques sur les cellules de propagation utilisant un anticorps contre Sycp3 (complexe synaptonémal [SC] protein 3, une composante latérale de l'élément).. L'image permet de conclure que fraction R3 correspond au début méiocytes (leptospirose / zygotène), dans lequel axes simples et courts tronçons de SC peut être vu, tandis que R4 contient méiocytes pachytènes, avec comcomplètement assemblé SC. Modifié à partir de Rodríguez-Casuriaga, et al., Cytométrie A. 79, 625 (2011). Cliquez ici pour agrandir la figure.
Figure 5. A) électrophorèse sur gel d'ARN totaux extraits de la spermatogenèse fractions cellulaires flow-triés 2C, R3 et R4 (explication sur les deux dernières fractions est la figure 4). Suspensions cellulaires ont été préparés avec le protocole décrit ici. B) Autoradiogramme d'un dénaturant gel d'électrophorèse de polyacrylamide montrant des bandes d'ADNc différentielles obtenues au moyen de la méthode "de l'ARNm de l'écart de l'écran" (RNAimage; GenHunter Corporation, Nashville, TN) pour l'une des combinaisons d'amorces à partir de la trousse. ARNm des trois mêmes populations de cellules, comme dans
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Discussion
La méthode décrite ici optimisé permet la préparation de suspensions de cellules de rongeurs tissu testiculaire d'une manière très rapide et reproductible, en évitant un traitement enzymatique et de détergent et de maintenir une bonne intégrité cellulaire et les proportions de types. La brièveté de la procédure (la durée de 15 minutes comprend dissection des testicules, la découpe des tissus, et la transformation), manipulations nécessaires sont minimales, et l'absence de traitements enzymatiques sont quelques-uns des principaux avantages. Toutes celles-ci représentent pour la bonne conservation des macromolécules courte durée de vie, ce qui est essentiel quand un échantillon représentatif des composés présents dans la population cellulaire d'origine est nécessaire.
Concernant l'utilisation de l'un PI ou Hoechst 33342, nous avons observé aucune différence évidente dans les profils résultant de l'analyse par cytométrie de flux de suspensions cellulaires du testicule avec l'emploi de l'un ou l'autre colorant. Le choix colorant va plutôt dépendre des préférences et disponibilités de l'utilisateur, etsur la poursuite de l'utilisation prévue. D'un côté, PI est moins cher, et de l'application généralisée que ne nécessite pas l'utilisation de cytomètres et trieurs ayant un laser UV. D'autre part, même si nous avons utilisé avec succès des cellules PI-colorées pour le tri ultérieur et les études d'expression différentielle de gènes (figure 4), Hoechst 33342 ou un autre colorant vital avec de faibles niveaux de cytotoxicité pourrait être le choix à privilégier pour les applications où la viabilité cellulaire complète est nécessaire, telles que la culture de cellules germinales et / ou une transplantation 4.
Nous avons été en mesure de trier les populations spécifiques de cellules ayant atteint plus de 95% de pureté soit pour les populations testiculaires sélectionnés avec différents contenus ADN 4 (Figure 3), ou même pour les sous-populations ayant la même teneur en ADN, mais différents niveaux de condensation de la chromatine (Figure 4). Ce dernier peut être réalisé tant que les sous-populations d'intérêt peuvent être individualisés dans les profils de cytométrie, particularly dans les parcelles de points. Par exemple, jusqu'à présent, nous avons été en mesure de trier les différentes étapes de la Guinée porc méiocytes I 9, mais pas de discriminer et de trier les sous-populations au sein de la population 2C simplement par coloration de l'ADN. Les cellules triées ont rendu ARN de bonne qualité, ce qui permet des analyses d'expression différentielle des gènes en aval 9 (figure 5).
Comme on peut le voir dans la description du protocole, il est très simple, facilement reproductible et ne nécessite pas de personnel spécialement qualifié. Nous considérons qu'il peut être adopté à une large variété d'applications impliquant la cytométrie de flux ou non. L'ancienne aire de répartition de l'analyse du contenu des testicules simple pour le contrôle rapide de l'avance spermatogenèse, à d'autres avec préparative vise tels que la purification des flux de populations de cellules spécifiques pour les études moléculaires ultérieures, comme indiqué ici.
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Acknowledgments
Ce travail a été financé en partie par le CSIC (I + D projet C022) et PEDECIBA. Les auteurs tiennent à remercier Mariela Bollati et Valentina Porro de l'Unité de biologie cellulaire (Institut Pasteur de Montevideo) pour leur généreuse collaboration concernant le trieur de cellules MoFlo, et Merial-Montevideo pour fournir doucement tous les échantillons de cobayes utilisés dans ce projet. Figure 1 a été reproduit avec l'autorisation de BioMed Central, figures 2 et 3, et le tableau 1 avec la permission de S. Karger AG, Bâle, et les figures 4 et 5 ont été reproduits ou adaptés avec la permission de John Wiley & Sons, Inc (copyright détenu par Wiley- Blackwell, 2011).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medimachine system | BD | 340587 | |
| Medicon unit (50 μm) | BD | 340591 | |
| Filcon unit (50 μm) | BD | 340603 | |
| DMEM | Gibco | 430-2100 | |
| Fetal calf serum | PAA | A11-151 | |
| NDA | Chemos BmbH | 277081 | |
| H–chst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Stock solution 5 mg/ml; used at a final concentration of 5 μg/ml |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | 287075 | Stock solution 1 mg/ml; used at a final concentration of 50 μg/ml |
References
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