Summary
酵素および洗剤を回避するげっ歯類の材料から精巣細胞懸濁液を機械的に調製するための新規なプロトコルは、記載されている。この方法は非常に簡単、迅速、再現性があり、フローソーティングおよびRNA抽出のために適している良質の細胞懸濁液を、レンダリングする。
Abstract
哺乳動物の精巣は、体精巣細胞と生殖細胞のさまざまな段階を含む、30以上の異なる種類の細胞が含まれている非常に複雑な器官である。精子開発の特定の段階で純粋なまたは濃縮された細胞集団は最も分子解析1のために必要とされるので、この不均一性は、哺乳類の精子形成の拠点の研究に関する重要な欠点である。
例えばStaput 2,3、遠心水簸1、およびフローサイトメトリー（FC）4,5等の各種戦略が異なる遺伝子発現研究を可能にするために、富化または精製された精巣細胞集団を得るために用いられてきた。
これは、細胞が最も濃縮/精製アプローチが懸濁液であることが必要である。理想的には、細胞懸濁液は、元の組織の代表となり、生細胞と少数multinucleatesの高い割合を持っている - ために形成する傾向があると不足細胞塊1 -精上皮6,7の合胞体性質。以前の報告では、もっぱら機械的な方法によって調製精巣細胞懸濁液は、トリプシン処理したもの1よりも容易に凝集していることも明らかでした。 RNアーゼおよび/または特定のダウンストリームアプリケーションのために望ましくない特定の高分子の劣化へのトリプシン及びコラゲナーゼ鉛のように分解する酵素で、一方、酵素処理。理想的なプロセスは、mRNAのようなその他の巨大分子の良好な保存を達成するために、可能な限り短くし、最小限の操作を含むべきである。固形組織からの細胞懸濁液の調製のための現在のプロトコルは、通常、時間がかかり、非常にオペレータに依存しており、選択的に特定の細胞型1,8に損傷を与えることができる。
ここで紹介するプロトコルは、と再現性の高い、非常に簡単な機械的な分解の利点を兼ね備えていますフローサイトメトリー分析および選別4、及び不純な遺伝子発現研究9に用いることができる良質の細胞懸濁液につながる酵素処理のbsence。
Protocol
1。細胞懸濁液の調製
- このような動物実験委員会または同等の専門委員会の勧告後に使用する試験片を生け贄に捧げる（ウルグアイ、国家委員会における動物実験のための[CNEA]）。我々のケースでは、ペントバルビタールの過剰摂取は、投与した。
- 標準的な承認された手順に従って、精巣を解剖し、氷冷DMEM、10 mlを入れ、氷の上に96ミリメートルのガラスペトリ皿に配置し、10％ウシ胎児血清を添加した。
- 白膜を取り外し、2の平方根の部分にカプセル開放精巣をカット - それぞれの側に3ミリメートル。
- それらの作品は、その後Medimachine、組織があきステンレススクリーン、金属ローターを含む使い捨てユニットの内側に細分化され自動化された機械的な粉砕機で処理されます。 50μmの使い捨てユニット、disaggregatorのスイッチ、その過程で、これらの作品の5 - そのためには、風邪の代わりに1ミリリットルはDMEMと4を補足メーカーからの簡単な指示に従う50秒のために。
- 針なしの5ミリリットルの注射器 - 3を使用して分解ユニットから得られた細胞懸濁液を回復。
- 以前にDMEMを補足0.5mlの浸し、50μmのナイロンメッシュを通して濾過する。
- 氷の上で浸した25μmのナイロンメッシュ、と場所を使用して再度サスペンションをフィルタリング。
- ノイバウアー室にカウントし、1に対する細胞濃度を調整- 2×10 7細胞/ ml添加したDMEMで。精巣材料の少なくとも4×10 7細胞/グラムは、通常得られる。
- 最後に、細胞凝集を防止するために0.2％の最終濃度にNDA（2 - ナフトール-6,8 - ジスルホン酸、カリウム塩）を追加する。
- オプション：製造者の指示に従って、動物細胞のための市販のキットに生存精巣細胞懸濁液の細胞生存率を確認する。
2。フローサイトメトリー分析
ve_content ">我々は、ヨウ化プロピジウムの高濃度（PI）により染色した細胞の分析のために488nmで発光するように調整されたコヒーレントアルゴンイオンレーザーを備えたベクトン·ディッキンソンFACSVantageフローサイトメーターを使用している。（未定着にPI入り口の問題ストレス下の細胞は、他の場所で9,10）対処されている。- PI染色のため、細胞懸濁液に50μgの/ mlの最終濃度で蛍光色素追加し、0℃で10分間インキュベート℃の暗所でC。
- レーザパワーは100mWに設定され、26分の575バンドパスフィルタFL2にPI-発せられる蛍光を収集するために使用される。
- 私たちは、70μmのノズルをFC測定を行う。精母細胞集団を選別するため、エンベロープとして3並べ滴を使用して、通常の-Rやノーマル-Cモードでソート設定。 3でのサンプルとコレクションチューブ保つ - 4°冷却ユニットを使用してC。毎秒500〜1,500の割合で細胞を分析するサンプルの差を調整します。
- 分析するセルクエストソフトウェア（BD）を使用次のパラメーター：前方散乱（FSC-H）、側方散乱（SSC-H）、総放出される蛍光またはパルス面積（FL2-）、および蛍光発光またはパルス幅（FL2-W）が持続。
代わりに、我々は5μgの/ mlの最終濃度に生体染色色素ヘキスト33342を採用し、37時10分°C、暗所でインキュベートした。細胞分析はMoFloサイトメーター（DakoCytomation）を用いて25mWでのUV励起波長のレーザを動作させて搭載し、70μmのノズルを用いて行った。データ操作はサミットv4.3のソフトウェア（DakoCytomation）を用いて行った。
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Representative Results
ここで説明されたプロトコルを用いて調製したラット精巣からよく分解された細胞懸濁液の例は、図1に示されている。
酵素処理6,8へと前述した機械的な分解方法2と比較すると、ここで紹介する1（特に他の機械に比べて、はるかに高速です少ないハンドリングを伴う、（not演算子に依存）を簡単に再現可能であり、希少細胞の破片をレンダリングメソッド）と非常に少ないmultinucleates（広範な組織操作1,2の結果として形成することが記載されている）。また、酵素処理とは対照的に、それは巨大分子の分解に有利に働く可能性がRNアーゼ、トリプシンおよびコラゲナーゼの使用を回避する。
一方、以前の報告は、排他的に機械的な方法により調製精巣細胞懸濁液をトリプシンでより容易に凝集していることも明らかたがエス1は、本発明の製造方法の適用は、非常に少ない、図1に見られるように、セルラ懸濁液に凝集レンダリング。その意味で、我々は、細胞凝集を防止し、その後流研究中にノズル詰まりを回避する上でNDAを含めることは非常に効率的な発見した。 図1は 、 図2に示すFCヒストグラムにおいても明らかである細胞破片の不足を明らかにする。
また、この方法で調製された細胞懸濁液は、精巣異なる細胞型の適切な表現を示す。これは、精細管の断面の細胞数から報告されたデータでここに示された方法により調製精巣細胞懸濁液の細胞組成を比較することにより締結し、細胞懸濁液と同様に、他の方法（ 表1）を用いて調製した。
FCヒストグラムpresaの複数形することにより調製懸濁液を得ntのプロトコルおよびヘキスト33342（ 図2A）またはPI（ 図2B）のいずれかで染色し、実質的に、プロシージャは、選択的に任意の特定の細胞型にダメージを与えないという仮定を支持し、以前に報告されたもの8異ならない。
| DNAの内容に基づいて精巣細胞タイプ | 無傷の精巣（％） | Medimachine -プリペア懸濁液B（％） | トリプシン処理懸濁液（％） |
| ） ハツカネズミ | |||
| C言語 | 66.2 | 62.5 | 79.6 |
| 2C | 16.4 | 18.4 | 7.3 |
| 4C </ TD> | 17.9 | 18.7 | 8.7 |
| 他人 | - | - | 4.6 |
| B） モルモット | |||
| C言語 | 66.5 | 65.5 | N / D |
| 2C | 11.0 | 11.5 | N / D |
| 4C | 22.5 | 23.0 | N / D |
| 細胞数は、顕微鏡観察により評価した。 B細胞数をフローサイトメトリーにより評価した。 | |||
表1。相対的なマウスからの細胞懸濁液のための彼らのDNA含量が異なる成人精巣細胞集団の割合（）とここに提示方法によって調製モルモット（B）、そのまま精巣と比較-マウス用の- T（ジンガーとロドリゲス·Casuriaga、Cytogenetから変更。 ゲノム解像度。128、46（2010））Oトリプシン準備懸濁液。 DNAの内容は以下のとおりです。C（円形および伸長精子細胞、精子）、2C（精巣体細胞、精原細胞、二次精母細胞）、および4C（一次精母細胞とG2の段階でいくつかの増殖精原細胞）。
図1。成体ラット精巣からの細胞懸濁液の部分図は、本プロトコルによって調製され、位相差顕微鏡で可視化した。分かるように、細胞細胞質がよく保存されている。バーは25μmのに対応しています。ロドリゲス-Casuriaga ら、BIOLから再生。 Proced。オンラインで11、184（2009）。
図2。成体ラット、マウス、モルモット、及び生体染色色素ヘキスト33342（）またはPI（B）で染色した21日から産後（DPP）ラット仔から精巣細胞懸濁液のFC DNA含量分析。すべてのケースでC、2Cと4Cの細胞集団は簡単に両方の染料と同様に、C群の左側に明らかにサブ半数体のピークを用いて得られたヒストグラムに開示することができます。この後者のピークはそれらの凝縮クロマチン状態12により別個未満、染色された亜集団として表示される精子を含むことが実証されている。すべてのグラフィックスにおける破片の不足に注意してください。これは、精子細胞と精子を欠い21 DPP（少年標本）プロファイル、特に明らかである。ジンガーとロドリゲス·Casuriaga、Cytogenetから変更。ゲノム解像度。128、46（2010）。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください。
図3。 4Cの細胞集団は、成体ラットの精巣細胞懸濁液からの並び順。順番細胞をクリーンポリ-L-リジン処理したスライド上に堆積し、ギムザ染色（B）の後、位相差顕微鏡（A）又は明視野で観察した。バーは=20μmである。ジンガーとロドリゲス·Casuriaga、Cytogenetから再生。ゲノム解像度。128、46（2010）。
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図4 A）FCここに記載されたプロトコルを用いて調製成体モルモット精巣細胞懸濁液の分析（）、ヒストグラム、（b）は 、ドットプロット。 PI-染色された細胞の4Cの細胞集団の2集団に注意してください。替え4CのR3からのセル（A、B）とR4（A '、B'）の領域B）の分析。（、 '）、落射蛍光顕微鏡像。 R3地域から核は比較的小さくなっていることに注意してください。バー：10μmの（B、B '）、Sycp3（シナプトネマ[SC]タンパク質3、横方向の元素成分）に対する抗体を用いたスプレッド細胞に対する免疫反応のレーザー共焦点顕微鏡。 R4はパキテン期meiocytesが含まれていますが、画像には、COMと、R3分数は単純軸とのSCの短いストレッチを見ることができるの早い段階で（lepto /接合期）meiocytes、に対応していることを結論することができます完全に組み立てられたのSC。ロドリゲス-Casuriaga ら 、 メトリから変更79、625（2011）。 大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください。
図5。精子形成フローソート細胞分画2C、R3及びR4（二後者の画分についての説明は、図4にある）から抽出した全RNAのA）アガロースゲル電気泳動。細胞懸濁液を、ここで記載されたプロトコルを用いて調製した。変性B）オートラジオグラムをキットからのプライマーの組み合わせのいずれかのために、 "のmRNAディファレンシャルディスプレイ"メソッド（GenHunterコーポレーション、ナッシュビル、TN RNAimage）によって得られた差分cDNAのバンドを示すポリアクリルアミド電気泳動ゲル。と同じ3つの細胞集団からmRNAを
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Discussion
ここで説明する最適化された方法は、酵素と界面活性剤処理を回避し、良好な細胞の完全性と型の比率を維持し、非常に高速かつ再現可能な方法で、げっ歯類の精巣組織からの細胞懸濁液の調製を可能にする。手順（15分スパンが精巣解剖、組織の切断、および処理が含まれます）、関係する最小限の処理、酵素処理の不在の簡潔さは、主な利点のいくつかである。これらはすべて、元の細胞集団中に存在する化合物の代表的なサンプルが必要な場合に重要で短寿命の巨大分子の良好な保存、会計処理する。
PIまたはヘキスト33342のどちらかを使用することに関しては、我々は、1つまたは他の染料の雇用と精巣細胞懸濁液を用いたフローサイトメトリー解析に起因するプロファイルには明らかな違いが認められなかった。染料の選択ではなく、ユーザーの好みや利用可能性に依存し、のさらなる使用を計画した。一方の側に、PIは安価であり、広範なアプリケーションのようなフローサイトメーターやUVレーザを有するソーターの使用を必要としない。他方では、我々が正常に低い細胞毒性レベルの不純なソートと異なる遺伝子発現研究（ 図4）、ヘキスト33342または他の生体染色色素のためのPI染色した細胞を使用しているが、完全な細胞生存率が必要とされる用途に好適な選択肢かもしれない生殖細胞培養および/ または移植4など。
我々は、別のDNA含量4（ 図3）で選択した精巣集団のために、あるいは同じDNA含量が異なるクロマチン凝縮レベル（ 図4）と亜集団の95％純度上で実現する特定の細胞集団をソートすることができた。興味のある集団は、サイトメトリープロファイルで個別化することができますので、この後者は、PA、長いように達成することができますrticularlyドットプロットである。例えば、これまでに我々はモルモットmeiocytes I 9のさまざまな段階を並べ替えることができましたが、単にDNAを染色することによって2Cの集団内集団を区別すると並べ替えることがありません。選別された細胞は、下流のディファレンシャルな遺伝子発現解析09（ 図5）ことができ、良質なRNAをレンダリングしている。
プロトコル記述から分かるように、容易に再現可能な、非常に単純であり、特に熟練した人員を必要としない。我々はそれをフローサイトメトリーかどうかを含む多種多様なアプリケーションを採用することができる考える。ここに示すように分取して、精子形成事前の迅速なチェックのためのシンプルな精巣の内容分析から他の人に前者範囲は、そのような不純分子の研究のための特定の細胞集団の流れの浄化などを目的としている。
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Acknowledgments
本研究の一部はCSIC（I + DプロジェクトC022）とPEDECIBAによってサポートされていました。著者は優しく、このプロジェクトで使用されているすべてのモルモット標本を提供するために細胞生物学MoFloのセルソーターに関する彼らの寛大なコラボレーションのためのユニット（パスツール研究所デモンテビデオ）、およびメリアル·モンテビデオからマリエラBollatiとヴァレンティナポロに感謝したいと思います。 図1図2と図3、およびS. KargerのAG、バーゼルの許可を得て、表1;; BioMedの中央の許可を得て再現しましたし、 図4と図5は、ジョン·ワイリー＆サンズ株式会社（が所有する著作権の許可を得て複製したり、適応したワイリーブラックウェル、2011）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medimachine system | BD | 340587 | |
| Medicon unit (50 μm) | BD | 340591 | |
| Filcon unit (50 μm) | BD | 340603 | |
| DMEM | Gibco | 430-2100 | |
| Fetal calf serum | PAA | A11-151 | |
| NDA | Chemos BmbH | 277081 | |
| H–chst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Stock solution 5 mg/ml; used at a final concentration of 5 μg/ml |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | 287075 | Stock solution 1 mg/ml; used at a final concentration of 50 μg/ml |
References
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