Summary
פרוטוקול חדש להכנה מכאנית של השעיות אשכים סלולריים מחומר מכרסם, הימנעות אנזימים וחומרי ניקוי, מתואר. השיטה היא מאוד פשוטה, מהירה, לשחזור, והופכת השעיות תא באיכות טובות, אשר מתאימות למיון זרימה ומיצוי RNA.
Abstract
אשכים יונקים הם איברים מורכבים מאוד המכילים יותר מ -30 סוגי תאים שונים, כוללים תאים הסומטיים אשכים ושלבים של תאי germline שונים. ההטרוגניות הזאת היא חסרון מהותי הנוגע למחקר מהבסיסים של spermatogenesis יונקים, כפי שאוכלוסיות תאים טהורות או מועשרת בשלבים מסוימים של התפתחות זרע יש צורך ברוב הניתוחים מולקולריים 1.
אסטרטגיות שונות כגון 2,3 Staput, elutriation צנטריפוגלי 1, וcytometry הזרימה (FC) 4,5 להיות מועסקת להשיג אוכלוסיות תאי אשכים מועשרים או מטוהרים על מנת לאפשר ביטוי במחקרי גן דיפרנציאלי.
נדרש כי תאים בתרחיף עבור רוב ההעשרה / טיהור גישות. באופן אידיאלי, את ההשעיה התא תהיה נציג של הרקמה המקורית, יש שיעור גבוה של תאי קיימא וכמה multinucleates - שנוטים להיווצר בגללטבע סינסיציאלי של האפיתל seminiferous 6,7 - וגושי תאי חוסר 1. דיווחים קודמים שמעידים כי השעיות תא אשכים שהוכנו על ידי שיטה מכאנית באופן בלעדי בכבדות בקלות רבה יותר מאשר אלה trypsinized 1. מצד השני, טיפולים אנזימטיים עם RNases ו / או אנזימי ריסוק כמו טריפסין וcollagenase להוביל לפירוק מולקולות ספציפי, אשר אינו רצוי עבור יישומים במורד הזרם מסוימים. התהליך האידיאלי צריך להיות קצר ככל האפשר, וכרוך במניפולציה מינימאלית, כדי להשיג שימור טוב של מולקולות של עניין, כגון mRNAs. פרוטוקולים הנוכחיים להכנת תאים מרקמות מוצקות מתלים הם בדרך כלל זמן רב, מאוד תלויים במפעיל, ועלולים לפגוע באופן סלקטיבי תאים מסוגים מסוימים 1,8.
הפרוטוקול המובא כאן משלב את היתרונות של disaggregation מכאני לשעתקו מאוד וקצר מאוד עםbsence האנזימטית של טיפול, מה שמוביל להשעיות תא באיכות טובות, שניתן להשתמש בם לניתוח תזרים cytometric ומיון 4, ומחקרי ביטוי גנים נסתרים 9.
Protocol
1. הכנת השעיות תא
- להקריב את הדגימה לשימוש בעקבות ההמלצות של הוועדות המיוחדות כגון IACUC (או שווה ערך באורוגוואי, הוועדה הלאומית לניסויים בבעלי החיים [CNEA]). במקרה שלנו, ממנת יתר של pentobarbital היה מנוהל.
- לנתח את האשכים בעקבות נהלים שאושרו סטנדרטיים ומניחים אותם בצלחת פטרי זכוכית 96 מ"מ על קרח, המכיל 10 מ"ל של DMEM קר כקרח בתוספת 10% נסיוב עגל עוברי.
- הסר albuginea Tunica ולחתוך את האשכים decapsulated לחתיכות מרובעות של 2 - 3 מ"מ בכל צד.
- חלקים אלה מעובדים מכן בMedimachine, מטחנה מכאנית אוטומטית שבו הרקמה מפוצלת בתוך יחידה חד פעמית המכילה מסך נירוסטה מחורר והרוטור מתכת. כדי לעשות זאת, מקום 1 מ"ל של קר בתוספת DMEM ו4 - 5 החלקים הללו ביחידת 50 מיקרומטר חד פעמית, לעבור על disaggregator, ותהליך 50 שניות לביצוע ההוראות הפשוטות מהיצרן.
- לשחזר את ההשעיה תא וכתוצאה מיחידת disaggregation באמצעות 3 - 5 מ"ל במזרק ללא מחט.
- לסנן דרך רשת ניילון מיקרומטר 50, ספגה בעבר עם 0.5 מ"ל DMEM בתוספת.
- סנן את ההשעיה שוב באמצעות רשת ספוגה 25 מיקרומטר ניילון, ומניח על קרח.
- לספור בתא נויבאואר ולהתאים את הריכוז סלולרי ל1 - 2 x 10 7 תאים / מ"ל עם DMEM בתוספת. לפחות 4 x 10 7 תאים / גרם חומר אשך בדרך כלל מתקבלים.
- לבסוף, להוסיף ל"ד (2-naphthol-6 ,8-disulfonic חומצה, מלח dipotassium) לריכוז סופי של 0.2% על מנת למנוע הצטברויות תא.
- אופציונלי: לבדוק כדאיות תא של השעיות תא אשכים עם ערכת כדאיות זמינה מסחרי לתאים של בעלי חיים, בעקבות הוראות יצרן.
2. ניתוח תזרים cytometric
ve_content "> השתמשנו cytometer זרימת FACSVantage בקטון דיקינסון-מצוידים בליזר יון ארגון קוהירנט מכוון לפלוט ב 488 ננומטר לניתוח תאים מוכתם בריכוזים גבוהים של יודיד propidium (PI). (הנושא של כניסה לצרכן מבולבל תאים תחת לחץ כבר התייחסו במקום אחר 9,10).- עבור מכתים PI, להוסיף fluorochrome בריכוז סופי של 50 מיקרוגרם / מ"ל להשעית התא, ודגירה במשך 10 דקות ב 0 מעלות צלזיוס בחושך.
- כוח לייזר מוגדר 100 מגה ואט ולעבור סינון להקה 575/26 משמש לאיסוף הקרינה נפלטת-PI בfl2.
- אנו מבצעים מדידות FC עם זרבובית 70 מיקרומטר. למיון אוכלוסיות spermatocyte, קבע מיון במצב רגיל-R או רגיל-C, באמצעות 3 טיפות ממוינות כמו מעטפה. שמרו על מדגם וצינורות איסוף ב3 - 4 מעלות צלזיוס באמצעות יחידת קירור. התאם ההפרש מדגם לנתח תאים בשיעור של 500 עד 1,500 לשנייה.
- השתמש בתוכנת CellQuest (BD) כדי לנתחאת הפרמטרים הבאים: פיזור קדימה (FSC-H); פיזור צד (SSC-H); הקרינה נפלטת כוללת או דופק אזור (fl2-), ומשך זמן של פליטת הקרינה או דופק ברוחב (fl2-W).
לחלופין, יש לנו מועסקים צבע Hoechst החיוני 33342 לריכוז סופי של 5 מיקרוגרם / מ"ל וטופחו במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בחושך. ניתוח תא בוצע באמצעות Cytometer MoFlo (DakoCytomation) המצוידים בהפעלת לייזר באורך גל עירור UV בMW 25 ובאמצעות זרבובית 70 מיקרומטר. מניפולציה של נתונים בוצעה עם תוכנת פסגת v4.3 (DakoCytomation).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
דוגמה של השעיה תא היטב פירוט רחב מאשכי עכברים שהוכנו עם הפרוטוקול המתואר כאן מוצגת באיור 1.
בהשוואה לטיפולים אנזימטיות 6,8 ולשיטות שתוארו לעיל disaggregation מכאניים 2, אחד המוצג כאן הוא הרבה יותר מהר, כרוך בפחות טיפול, הוא לשחזור בקלות (לא מפעיל תלוי), והופך את פסולת תא נדירה (במיוחד בהשוואה למכונות אחרות שיטות) ומעט מאוד multinucleates (שכבר תאר בצורה כתוצאה של מניפולציה רקמות נרחבת 1,2). יתר על כן, בניגוד לטיפולים אנזימטיות, זה ימנע את השימוש של RNases, טריפסין וcollagenase, שעלול להעדיף מקרומולקולות השפלה.
מצד השני, למרות דיווחים קודמים שמעידים כי השעיות תא אשכים שהוכנו על ידי שיטה מכאנית באופן בלעדי בכבדות בקלות רבה יותר מאשר בtrypsinized1 ES, היישום של השיטה הנוכחית שניתנו מעט מאוד להתנהל בכבדות בהשעיות הסלולריות, כפי שניתן לראות באיור 1. במובן זה, שמצאנו את ההכללה של בל"ד מאוד יעילה במניעת הצטברויות תא, והימנעות מסתימת נחיר זרימה במהלך הלימודים הבאים. איור 1 מגלה גם המחסור של תא פסולת, שהוא גם מובן מאליו בהיסטוגרמות FC מתוארות באיור 2.
חוץ מזה, השעיות תא שהוכנו בשיטה זו מראות ייצוג הולם מסוגי תאי האשכים השונים. זה הגיע למסקנה על ידי השוואת ההרכב התאי של השעיות תא אשכים שהוכנו על ידי השיטה שהוצגה כאן עם הנתונים שדווחו מספירת תאים בחתכים של seminiferous צינוריות, ועם השעיות תא שהוכן תוך שימוש בשיטות אחרות, כמו גם (טבלת 1).
FC היסטוגרמות מתקבלים להשעיות שהוכנו על ידי preseNT פרוטוקול ומוכתם או עם Hoechst 33342 (איור 2 א) או PI (איור 2) אינו שונה באופן מהותי מאלה שדווחו בעבר 8, גם תומך בהנחה שההליך לא יפגע באופן סלקטיבי לכל סוג תא מסוים.
| סוגי תאי אשכים המבוססים על תוכן ה-DNA | אשך ללא פגע (%) | השעיות מוכנות b (%) - Medimachine | השעיות trypsinized (%) |
| מאסכאלאס) Mus | |||
| ג | 66.2 | 62.5 | 79.6 |
| 2C | 16.4 | 18.4 | 7.3 |
| 4C </ P> | 17.9 | 18.7 | 8.7 |
| אחרים | - | - | 4.6 |
| B) Cavia porcellus | |||
| ג | 66.5 | 65.5 | N / D |
| 2C | 11.0 | 11.5 | N / D |
| 4C | 22.5 | 23.0 | N / D |
| תא ספירה הוערכה על ידי התבוננות Microscopical. ספירת תא B הוערכה על ידי cytometry הזרימה. | |||
טבלת מס '1. האחוזים יחסיים של אוכלוסיות תאי אשכים למבוגרים שונות בתוכן ה-DNA שלהם להשעיות תא מעכבר () והחזיר (ב ') שהוכן על ידי השיטה מובאת בזאת, בהשוואה לאשך ללא פגע ו-- לעכבר - T השעיות o טריפסין סיים (שונות מGeisinger ורודריגז-Casuriaga, Cytogenet. Res הגנום. 128, 46 (2010)). תוכן ה-DNA הוא: C (עגול ומתארך, spermatids זרע), 2C (תאים סומטיים אשכים, spermatogonia, spermatocytes משניים), ו4C (spermatocytes הראשוני וכמה spermatogonia מתרבה בשלב G2).
איור 1. מראה חלקי של השעיה תא מאשך עכברוש מבוגר שהוכן על ידי הפרוטוקול הנוכחי ומדמיין ידי מיקרוסקופ לעומת השלב. כפי שניתן לראות, cytoplasms הסלולרי נשמרים היטב. הבר מתאים ל25 מיקרומטר. לשכפל מרודריגז-Casuriaga, et al., Biol. Proced. באינטרנט. 11, 184 (2009).
-Together.within עמודים = "תמיד"> 
איור 2. ניתוח FC-DNA של תוכן השעיות תא אשכים מחולדות מבוגרות, עכברים, שרקנים, ומלידתי 21 ימי הודעה (DPP) גורי חולדה, מוכתם בצבע Hoechst החיוני 33342 () או עם PI (ב '). בכל המקרים יכולות להימסר אוכלוסיות תאי C, 2C ו4C קלות ביסטוגרמות שהושגו עם שני הצבעים, כמו גם את השיא כנראה תת ההפלואידים בצד השמאל של אוכלוסיית ג. השיא אחרון זה כבר הוכיח שיכיל את תאי הזרע, המופיעים כsubpopulation נפרד, פחות מוכתם בשל מצב הכרומטין 12 המתומצת שלהם. שים לב למחסור בפסולת בכל הגרפיקה. זה בא לידי ביטוי במיוחד בDPP 21 (פרטים צעירים) פרופילים, שחסר spermatids ותאי זרע. שונה מGeisinger ורודריגז-Casuriaga, Cytogenet. מיל הגנום. 128, 46 (2010). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 3. אוכלוסיית תא 4C מסודרים מהשעית תא אשכים של עכברים בוגרים. תאים ממוינים הופקדו על גבי שקופיות פולי-L-ליזין שטופלו נקיות ונצפה תחת מיקרוסקופ שלב בניגוד () או שדה בהיר לאחר צביעת Giemsa (ב '). בר = 20 מיקרומטר. לשכפל מGeisinger ורודריגז-Casuriaga, Cytogenet. מיל הגנום. 128, 46 (2010).
tp_upload/50102/50102fig4highres.jpg "/>
. איור 4) ניתוח FC של השעיה למבוגרים חזיר אשכי תא מוכנה עם הפרוטוקול מתואר כאן (א), היסטוגרמה;. (ב), עלילת נקודה. שימו לב שתי האוכלוסיות באוכלוסיית תא 4C. ב ') ניתוח של תאים ממוינים מR3 4C (A, B) וR4 (', ב ') אזורים. (,'), תמונות מיקרוסקופ epifluorescence של תאי PI מוכתמים . שימו לב שהגרעינים מאזור R3 הם יחסית קטנים יותר. בר: 10 מיקרומטר (ב ', ב'), מיקרוסקופיה confocal לייזר של תגובות immunocytochemical על תאי מרווח באמצעות נוגדנים נגד Sycp3 (Synaptonemal המורכב [SC] חלבון 3, מרכיב יסוד לרוחב).. התמונה מאפשרת למסקנה שחלק R3 המתאים (lepto / zygotene) meiocytes המוקדמת, שבו ניתן לראות צירים פשוטים ומותח של התחדשות קצר, תוך R4 מכיל meiocytes pachytene, עם completely התאסף ספורטיביים. שונה מרודריגז-Casuriaga, et al., Cytometry. 79, 625 (2011). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 5. א) אלקטרופורזה agarose ג'ל של RNAs סך הכל חולץ מן הזרע הראשוני ממוינים זרימת שברים סלולריים 2C, R3 ו R4 (הסבר על שני השברים האחרונים הוא באיור 4). השעיות תא הייתה מוכנה עם הפרוטוקול שתואר כאן. ב ') Autoradiogram של denaturing ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide מראה להקות cDNA דיפרנציאלי שהושגו באמצעות שיטת "mRNA ההפרש התצוגה" (RNAimage; תאגיד GenHunter, נשוויל, טנסי) לאחד שילובי פריימר מהערכה. mRNAs מאותם שלוש אוכלוסיות תאים כמו ב
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה האופטימלית המתוארת כאן מאפשרת הכנה של השעיות תא מרקמת אשך מכרסם בדרך מהירה ולשעתק מאוד, הימנעות מטיפול אנזים וחומר ניקוי ושמירה על שלמות תא טובה ופרופורציות סוג. קיצורו של הנוהל (תוחלת 15 דקות כוללת נתיחת אשך, חיתוך רקמות, ועיבוד), הטיפול מינימאלי המעורבים, והיעדר טיפולים אנזימטיים הוא כמה מהיתרונות העיקריים. כל אלה יכולים להסביר את השימור הטוב של מקרומולקולות חיים קצרות, שהוא קריטי כאשר נדרש מדגם מייצג של תרכובות הנמצאות באוכלוסיית התא המקורית.
בנוגע לשימוש גם לצרכן או Hoechst 33342, יש לנו לא מצאו הבדלים ניכרים בפרופילים הנובעים מניתוח תזרים cytometric של השעיות תא אשכים עם התעסוקה של אחד או צבע האחר. בחירת הצבע ולא תהיה תלויה בהעדפות וavailabilities של המשתמש, ובשימוש נוסף מתוכנן. מצד אחד, חוקר הפרטי הוא זול יותר, ויישום הנרחב של כאינו דורש שימוש בcytometers הזרימה וממיינים בעלי לייזר UV. מצד השני, למרות שיש לנו בהצלחה בשימוש בתאים PI מוכתם למיון נסתר ומחקרי ביטוי גנים דיפרנציאלי (איור 4), Hoechst 33342 או צבע חיוני אחר עם רמות נמוכות cytotoxicity יכול להיות הבחירות עדיפות ליישומים בהם נדרשים כדאיות תא מלאה, כגון תרבות נבט תא ו / או השתלה 4.
אנחנו כבר מסוגלים למיין אוכלוסיות תאים ספציפיות שהשיגו מעל 95% טוהר או לאוכלוסיות אשכים נבחרות עם תוכן שונה DNA 4 (איור 3), או אפילו לאוכלוסיות עם אותו תוכן ה-DNA, אך רמות עיבוי הכרומטין שונות (איור 4). זו אחרונה יכולה להיות מושלמת כל עוד יכול להיות אישית את subpopulations של עניין בפרופילי cytometric, הרשות הפלסטיניתrticularly בחלקות נקודה. לדוגמה, עד עכשיו יש לנו כבר מסוגלים למיין שלבי פן ניסיונות meiocytes אני 9 שונים, אבל לא להפלות ולמיין אוכלוסיות בתוך אוכלוסיית 2C פשוט על ידי מכתים את ה-DNA. תאים ממוינים יש שניתנו RNA באיכות טובה, המאפשרים ביטוי גנים ניתוחים דיפרנציאליים מורד הזרם 9 (איור 5).
כפי שניתן לראות בתיאור הפרוטוקול, זה מאוד פשוט, לשחזור בקלות, ואינו דורש כוח אדם מיומן במיוחד. אנחנו רואים את זה יכול להיות מאומץ למגוון רחב של יישומים הכוללים cytometry זרימה או לא. הטווח לשעבר מניתוח תוכן אשכים פשוט לבדיקה המהירה של זרע ראשוני מראש, לאחרים עם preparative מטרה כגון טיהור זרימה של אוכלוסיות תאים ספציפיות למחקרים מולקולריים נסתרים, כפי שמוצג כאן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי CSIC (אני + D פרויקט C022) וPEDECIBA. המחברים מבקשים להודות לMariela Bollati ולנטינה Porro מיחידת הביולוגיה של התא (המכון פסטר דה מונטבידאו) לשיתוף הפעולה הנדיב שלהם בנוגע לסדרן תא MoFlo, וMerial-מונטווידאו לעדינות מספק את כל הדגימות שרקנו המשמשות בפרויקט זה. איור 1 שוחזר באישור ביומד המרכזי; איורים 2 ו -3, ולוח 1 באישורו של ס 'Karger AG, באזל, ואיורים 4 ו -5 היו לשכפל או מותאמים באישור של John Wiley & Sons, Inc (זכויות יוצרים שבבעלות Wiley- בלקוול, 2011).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medimachine system | BD | 340587 | |
| Medicon unit (50 μm) | BD | 340591 | |
| Filcon unit (50 μm) | BD | 340603 | |
| DMEM | Gibco | 430-2100 | |
| Fetal calf serum | PAA | A11-151 | |
| NDA | Chemos BmbH | 277081 | |
| H–chst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Stock solution 5 mg/ml; used at a final concentration of 5 μg/ml |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | 287075 | Stock solution 1 mg/ml; used at a final concentration of 50 μg/ml |
References
- Meistrich, M. L. Separation of spermatogenic cells and nuclei from rodent testes. Methods of Cell Biology. Prescott, D. M. 15, Academic Press. New York. 15-54 (1977).
- Lam, D. M. K., Furrer, R., Bruce, W. R. The separation, physical characterization, and differentiation kinetics of spermatogonial cells of the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 65, 192-199 (1970).
- Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcet, D. W. Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. Dev. Biol. 19, 119-131 (1976).
- Geisinger, A., Rodríguez-Casuriaga, R. Flow cytometry for gene expression studies in mammalian spermatogenesis. Cytogenet. Genome Res. 128, 46-56 (2010).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J. Vis. Exp. (50), e2602 (2011).
- Meistrich, M. L. Separation of mouse spermatogenic cells by velocity sedimentation. J. Cell Physiol. 80, 299-312 (1972).
- Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation. Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).
- Malkov, M., Fisher, Y., Don, J. Developmental schedule of the postnatal rat testis determined by flow cytometry. Biol. Rep. 59, 84-92 (1998).
- Rodríguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santiñaque, F., López, B., Folle, G. High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells. Cytometry A. 79, 625-634 (2011).
- Davey, H. M., Hexley, P. Red but not dead? Membranes of stressed Saccharomyces cerevisiae are permeable to propidium iodide. Environ. Microbiol. 13, 163-171 (2011).
- Rodríguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., López-Carro, B., Porro, V., Wettstein, R., Folle, G. A. Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis. Biol. Proced. Online. 11, 184-195 (2009).
- Spanò, M., Evenson, D. P. Flow cytometric analysis for reproductive biology. Biol Cell. 78, 53-62 (1993).
