Summary
En kontusion model af alvorlig rygmarvsskade er beskrevet. Detaljerede præ-operative, operative og postoperative trin beskrives at opnå en konsistent model.
Abstract
Den translationelle potentiale nye behandlinger bør undersøges alvorlig rygmarvsskade (SCI) kontusion modeller. En detaljeret metode beskrives for at opnå en ensartet model af svær SCI. Anvendelse af en stereotaktisk ramme og computerstyret attrappen muliggør skabelsen af reproducerbar skade. Hypotermi og urinvejsinfektion store udfordringer i den postoperative periode. Omhyggelig monitorering af dyr med daglig vægt optagelse og blære udtryk giver mulighed for tidlig påvisning af postoperative komplikationer. De funktionelle resultater af denne kontusion model svarer til transection modeller. Den kontusion model kan anvendes til at evaluere effekten af både neuroprotektive og neuroregenerative tilgange.
Introduction
Valg af passende personskade model er afgørende for præklinisk evaluering af nye behandlinger for rygmarvsskade (SCI). 1,2,13 I en nylig undersøgelse af læger og forskere inden for neurotrauma kontusion model, i modsætning til hemisection eller komplette transection modeller blev alment accepteret at være klinisk relevant. 8 Denne udtalelse er baseret på den observation, at flertallet af rygmarvsskade hos mennesker er contusive i naturen. 10. biologi kontusion synes også at være forskellig fra hemisection eller transection modeller. 11. Iseda, et al. sammenlignede effekten af intraspinal chondroitinase ABC injektion på neuroregeneration separat i hemisection og kontusion modeller. 4. axonal regenerering blev observeret i det neuronale bro i hemisection men ikke kontusion SCI gruppen. Den hemisection eller komplette transection modeller også skabe forhold, der vides at eksistere i kun en meget lille delmængde af clinical omstændigheder. For eksempel har adskillige forskere ansat stillads-baserede tiltag til implantation i læsionen hulrum efter hemisection eller fuldstændig overskæring at fremme regenerering. 6. Denne fremgangsmåde bliver klinisk irrelevant, fordi skabelsen af et hulrum inden tilskadekomne rygmarv er upraktisk og sandsynligvis uetisk.
Variation i funktionelle opsving er fortsat en stor udfordring for kontusion modeller. 5,12 Denne variabilitet kan minimeres ved brug af computer-kontrollerede attrappen og stabilisering af rygsøjlen før kollisionen for ensartet force levering i hele rygmarven volumen især de ventralt placeret motor veje . Det skal bemærkes, at plasticitet og sikkerhed bidrag fra overlevende axoner er den dominerende mekanisme for restitution efter rygmarvsskade. 1. Derfor selv mindre variationer i kontusion teknik kan give betydeligt forskellige resultater. Til dette formål har vi udvikleten model af alvorlig rygmarvsskade, som giver ensartet kontusion volumen og funktionel genopretning sammenlignes med overskæring modeller. Denne model kan anvendes til at undersøge både neuroprotection og neuroregeneration strategier som et proof of concept for behandlingseffekt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Forberedelse Før Rygmarvsskader
De kirurgiske instrumenter, der er nødvendige for denne procedure er skalpel pickups med og uden tænder, hemostats, self støttemure retraktorer, fine tip Rongeurs, nål driver, resorberbare suturer, og huden klip applikatorer. Andre kirurgiske nødvendige forsyninger er operationsdraperinger, sterile plader til kirurgiske område, gaze svampe, bomuld-tip applikatorer, og metalfolie. Autoklave de kirurgiske instrumenter samt udstyr forud for operationen. Brug det enkelte sæt af instrumenter og forsyninger til et dyr. Rengør kirurgiske område og apparater (attrappen, lyskilde, stereotaktisk ramme, glas perle sterilisatorer og varmepuder) med spritservietter.
Åbn operationsdraperinger og bruge sterile handsker at drapere det kirurgiske område omhyggeligt undgår forurening. Åbne de enkelte instrumenter sterilt og omhyggeligt placere dem i det kirurgiske område. Dæk knapper og håndtag af the apparat sandsynligvis behov under proceduren med det sterile metalfolie. Switch-on glasperlen sterilisator at være klar til brug i løbet af proceduren.
2.. Forberedelse af dyrene
Bring rotterne til laboratoriet området få hr før den egentlige procedure. Administrere smertestillende medicin mindst én time forud for den forventede procedure (typisk buprinorphine 1,5 ml 0,006 mg / ml subkutan). Administrere præoperative antibiotika (typisk Baytril 4 mg / kg subkutant). Bedøver rotterne med 90 mg / kg Ketamin og vente, indtil der er ingen tå-pinch reaktion. Palpere den mest fremtrædende spinosus proces i brysthvirvelsøjlen. Dette niveau svarer typisk med T10 spinosus proces. Markér placeringen af hensigten niveau i forhold til T10. I vores laboratorium udfører vi en T10 skade. Følgende fortælling beskriver teknik T10 SCI. Shave en 3 cm x 6 cm rektangel langs og centreret på T10-niveau. Rens huden tre gange with Betadine løsning. Påfør oftalmologiske smøremiddel på hvert øje. Overfør rotte i en behagelig stilling til det kirurgiske område omhyggeligt undgår kontaminering. Indsæt en rektal temperatursonde at overvåge kernetemperatur og justere opvarmning tilsvarende for at holde dyr temperatur så tæt på normal (~ 37,5 ° C) som muligt. Dæk rotte med en kirurgisk afdækningsstykke med et vindue over operationsstedet.
3.. Kirurgisk procedure
Begynd med en omtrentlig 4 cm snit ved hjælp af en # 10 klinge centreret om T10 mærket. Fortsæt til tålmodigt dissekere fascia og muskel lag væk fra de T9-T11 torntappe og laminae. Placer retraktorer at trække muskler og fascia væk fra knoglen. Mens stabilisere spinosus proces T9 skarpt opdele interspinous ligament mellem T9 og T10 bruger fine saks. Tilsvarende stabilisere T10 Torntappe og opdele interspinous ledbånd mellem T10-T11. Brug loop forstørrelse supplete opdelingen af ledbånd hele vejen igennem ligamentum flavum (figur 1). Den thecal sac er umiddelbart indlysende, når ligamentum flavum er afbrudt. Brug fin spids Rongeurs til omhyggeligt udføre stykvis laminectomy bilateralt på T10. Yderste omhu for at undgå et nedadgående pres på thecal sæk og utilsigtet skade af rongeur tips. Lamina og spinosus proces T10 er helt fjernet.
Flyt dyret på plads på stabilisering platform. Brug stabiliserende klemmer til at immobilisere rygsøjlen ved at spænde de laterale aspekter af T11 corpus vertebrae efterfulgt af de laterale sider af T9 corpus vertebrae. Vær omhyggelig med ikke at komprimere rotten i platformen med de stabiliserende klemmer da dette ville begrænse plads til respiratoriske bevægelser og tilsæt uønsket stress dyret. Efter at have sikret rygradsdelene indstillinger på computer-styrede attrappen er markeret. Vi bruger typisk slaglegeme spids på 3,0 mm ved en spBehov på 4 cm / s med en dybde på 2 mm og en opholdstid på 0,3 sek. Forlæng slaglegemet spids og sænk det, indtil det netop rører ledningen overflade. Træk spidsen og sænke anordningen 2 mm mod rygmarven overflade. Slip stemplet på 4 cm / sek forårsage alvorlig kontusion rygmarvsskade. Attain hæmostase hjælp lige nok pres for at holde bomuld-tip applikator på plads, være omhyggelig med ikke at skabe nogen unødvendigt pres på ledningen. Sutur muskler og fascia lag med en figur-8 sting være omhyggelig med ikke at trække for stramt hjælp absorberbare suturer. Luk huden med et minimum af 2 små hæfteklammer, op til 4 eller 5 hæfteklammer kan anvendes, hvis dele af indsnit forblive åben efter de første 2 eller 3 hæfteklammer.
3.. Post-procedure Care
Sted rotter i et varmt miljø på ca 33-35 ° C i 24 timer post-kirurgi. Dette medfører en inkubator (mens de er bevidstløs) og en opvarmet bur plads, når de begynder at bevæge sig. Når rotter er fuldt awake, administrere 5 ml saltvand, 1,5 ml (0,006 mg / ml) af buprinorphine, og 0,1 ml Baytril alle subkutant. Fortsæt med buprinorphine subkutant to gange om dagen for første 24-48 timer og Baytril gang om dagen i 7 dage. Blærer bør manuelt udtrykkes tre gange om dagen, indtil tilbagevenden af blære funktion (<2 ml urin i tidlig morgen ekspression i 3 på hinanden følgende dage). Dyrene skal også kontrolleres i løbet af denne tid for infektion (blod i urinen, hvidlig farve eller dårlig lugt), nedsat fysisk aktivitet eller problemer med sårheling. Tilstedeværelse af smitte bør imødegås med en øget dosis (eller re-initiering) af antibiotika i samråd med de lokale dyrlæger. Afvejes rotter dagligt begynder dagen efter operationen for at vurdere deres recovery.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lesion Volume
Vi har opnået store og konsekvent læsion volumen ved at følge den ovenfor beskrevne teknik. Ved hjælp af en Luxol hurtig blå farvning en gennemsnitlig læsion volumen på 2,04 mm 3 (95% CI 1,9-2,18) (n = 5 dyr) blev opnået. Figur 2 viser betyde læsion volumen med en repræsentativ farvning med Luxol Fast Blue gennem læsionen epicentret.
Funktionelle Scores
De adfærdsmæssige resultater som målt ved Basso Beattie, Bresnahan (BBB) skala er vist i fig. 3. Efter 12 uger rotterne i kontrolgruppen opnåede en gennemsnitlig BBB score på 2,2 ± 1,1 (n = 10 dyr).
Andre parametre
Baseret på vores seneste erfaring med 32 dyr operationer overlevelsesraten for denne teknik er 93,4%. Alle dødelighed var relateret til vedvarende urinvejsinfektion (UTI) efterfulgt af animalsk offer for at undgå overdreven smerte og lidelse. Efter endt kursus af antibiotika i 7 dage 16,7% dyr udviklede UTI. Det gennemsnitlige antal dage til påvisning af UTI postoperativ var 14,6 ± 7,6 dage. Interessant dyrene nået blærekontrol på gennemsnitligt 13 dage efter skaden (gennemsnit 13,33 ± 3,6 dage). Rotter, der udviklede UTI tog længere tid at opnå blærekontrol sammenlignet med rotterne uden UTI (Blære kontrol i rotter med UTI - 16 ± 1 dage versus 12,8 ± 3,7 dage for blære kontrol hos rotter uden UTI, p = 0,03). I kohorte, der opnås blærekontrol inden 14 dage ingen efterfølgende UTI blev opdaget. Som vist i figur 4, der var en første gevinst i vægt efter SCI sandsynligt fra væskeretention. Vægten faldt efterfølgende og stabiliseres til et lavere niveau (ca. 10-12% lavere end baseline) i omkring 10 dage.
/ Files/ftp_upload/50111/50111fig1highres.jpg "/>
Figur 1. Vertebral anatomi rotte fra den bageste tilgang (venstre) viser torntappene og laminae. Stilling ligamentum flavum (LF) er afbildet i rummet mellem lagene. Mid-saggital sektion (højre) viser den relative position af ligamentum flavum og interspinous ligament i forhold til rygmarven.
Figur 2. Søjlediagram, der viser læsion volumen (i mm 3, Y-akse) i dyr, der modtog alvorlig rygmarvsskade (venstre). En repræsentant længdesnit gennem skade epicentret efter Luxol hurtig blåfarvning (højre).
g3highres.jpg "/>
Figur 3. Mean BBB (Y-akse) score af rotterne i løbet af 3. måneders opfølgning (X-akse) viser minimal opsving typisk for svær SCI.
Figur 4.. Line diagram, der viser variationen i daglig vægt (i g, Y-akse) af rotter over 2 ugers varighed (X-akse) efter induktion af rygmarvsskade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Adskillige nye behandlinger har for nylig vist tidligt løfte i området SCI forskning. 3. Omhyggelig evaluering af disse behandlinger er afgørende i klinisk relevant model for SCI at vælge strategier med maksimal translationel potentiale. En ordning for sortering for nylig blev udviklet til at vurdere styrken af prækliniske undersøgelser. 9. Denne ordning understregede vigtigheden af at udnytte kontusion model af svær SCI. Her beskriver vi sådan en kontusion model af svær SCI med ensartede læsion volumen og funktionelle scores op ad den pågældende transection modeller. Denne model kan anvendes som en "proof of concept" for at etablere behandlingseffekt både neuroprotection og neuroregeneration strategier.
Den generation af ensartede contusive SCI stadig udfordrende. For reproducerbarhed, er det vigtigt, at skaden udføres så ensartet som muligt. Den målrettede niveau af rygmarven skal identificeres konsekvent frabout dyr til dyr. Fjernelse af knoglen under laminectomy skal udføres omhyggeligt for at sikre, at ingen knoglefragmenter er tilbage i rygmarvskanalen, disse kan forårsage kompression skade og indføre uønskede variationer i skade mekanismer og recovery potentiale. Vi har vedtaget en række skridt til at sikre ensartethed, herunder størrelsen af, stift stabilisering af rygsøjlen på en ramme med monteret stabiliserende arme, ved hjælp af en ensartet hastighed, og dybden af impaction. Det er vigtigt, at rotten anbringes komfortabelt, når de stabiliserende pincet er fastspændt til hvirvellegemerne. Eventuelle variationer i spinal justering eller overskydende stress under fastspænding kan ændre biomekanik effekt. Vi anvendte en 2,5 mm slaglegemet da den gennemsnitlige størrelse af rotte rygmarv i vores region af interesse er 2,5-3 mm. Kontakttiden eller dvæle blev ensartet indstilles til 0,3 sek i vores eksperimenter. Men i vores observation og rapporter fra andre laboratorier, for en alvorlig model SCI dybden af virkningen er den mest afgørendeparameter. I eksperimenterne beskrevet i dette dokument virkningen blev leveret ved en konstant dybde på 2 mm. Andre faktorer, der påvirker ensartethed omfatter uddannelse af personale, klar visualisering af væv, og attrappen tip til at sikre direkte indvirkning på ledningen væv (og ikke de knoglestrukturer).
Rotterne skal konstant observeret under proceduren for de nødvendige livstegn vigtigst kernetemperatur og vejrtrækning. Hypotermi er den førende årsag til dødelighed under og umiddelbart efter anæstesi administration. Overvågning af kernetemperatur med rektal sonde og passende varmepuder vil undgå denne komplikation. Hvis vejrtrækningen bliver uregelmæssig eller dyret ophører med at ånde, bør proceduren straks standses, indtil vejrtrækningen vender tilbage til udgangspunktet. Overdreven smerte og eller utilsigtet overdosering af smerte og bedøvelse medicin kan også resultere i vejrtrækningsproblemer. Rotterne bør overvåges nøje efter procedure. Deres wottere bør måles præcist og et tab på> 20% fra baseline vægt bør foranledige en undersøgelse mad og vand indtag, urinvejsinfektion, nedbrydning af huden, post-SCI ileus, etc. Early samråd med dyrlæger for udredning og behandling er afgørende i sådanne situationer. Som diskuteret tidligere, skulle rotter, der er ikke genvundet blære kontrol på dag 14 blive startet igen på antibiotika for at undgå en potentielt dødelig urinvejsinfektion.
Rygmarvsskade kan induceres ved enten en forskydning metode eller konstant kraft metode. 5,12 Teknikken beskrevet i dette papir er forskydning metode, hvor kraft leveres til fast dybde i rygmarven væv. Brugen af en computer-styret attrappen giver mulighed for en grad af kontrol, som ikke er opnåeligt ved andre almindelige metoder til eksperimentel SCI. Klippet komprimering teknik tillader ikke en stump, contusive kraft med øjeblikkelig frigivelse, mens NYU effekteller afhænger tyngdekraften til at bestemme kraft kontusion. Disse teknikker selv reproducerbar, ikke tillader simulering af betingelserne opstod under et motorkøretøj ulykke, den mest almindelige årsag til akut SCI hos mennesker. Tidligere undersøgelser har vist, at skaden sværhedsgrad direkte korreleret med dybde virkning end hastigheden af virkningen. 7. Derfor denne model giver mulighed for en alvorlig SCI rutinemæssigt at foretage med potentiale til at ændre sværhedsgraden gennem en større vifte af kombinationer af kraft og forskydning .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Finansielle oplysninger none
Finansiering offentliggørelse ingen.
Acknowledgments
Forfatterne er taknemmelige for Dr. N. Banik og Dr. D. Mitchell for deres vejledning i udviklingen af denne model.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computer controlled impactor | Leica or the Infinite Horizons (formerly OSU) impactor | ||
| Surgical instruments | |||
| Scissors | Fine Science Tools Inc | 14094-11 or 14060-09 | |
| Forceps | Fine Science Tools Inc | 11006-12 and 11027-12 or 11506-12 | |
| Hemostats | Fine Science Tools Inc | 13009-12 | |
| Retractors | Fine Science Tools Inc | 17011-10 | |
| Rongeurs | Fine Science Tools Inc | 16020-14 | |
| Needle driver | Fine Science Tools Inc | 12001-13 | |
| Stereotactic frame | Leica or RWD Life Science Co. or TSE systems | ||
| Buprinorphine | |||
| Baytril | Bayer | ||
| Ketamine | |||
References
- Blesch, A., Tuszynski, M. H. Spinal cord injury: plasticity, regeneration and the challenge of translational drug development. Trends Neurosci. 32, 41-47 (2009).
- Dobkin, B. H. Curiosity and cure: translational research strategies for neural repair-mediated rehabilitation. Dev. Neurobiol. 67, 1133-1147 (2007).
- Fehlings, M. G., Cadotte, D. W., Fehlings, L. N. A series of systematic reviews on the treatment of acute spinal cord injury: a foundation for best medical practice. J. Neurotrauma. 28, 1329-1333 (2011).
- Iseda, T., Okuda, T., Kane-Goldsmith, N., et al. Single, high-dose intraspinal injection of chondroitinase reduces glycosaminoglycans in injured spinal cord and promotes corticospinal axonal regrowth after hemisection but not contusion. J. Neurotrauma. 25, 334-349 (2008).
- Khan, T., Havey, R. M., Sayers, S. T., et al. Animal models of spinal cord contusion injuries. Laboratory Animal Science. 49, 161-172 (1999).
- Kim, B. G., Kang, Y. M., Phi, J. H., et al. Implantation of polymer scaffolds seeded with neural stem cells in a canine spinal cord injury model. Cytotherapy. 12, 841-845 (2010).
- Kim, J. H., Tu, T. W., Bayly, P. V., et al. Impact speed does not determine severity of spinal cord injury in mice with fixed impact displacement. Journal of Neurotrauma. 26, 1395-1404 (2009).
- Kwon, B. K., Hillyer, J., Tetzlaff, W. Translational research in spinal cord injury: a survey of opinion from the SCI community. J. Neurotrauma. 27, 21-33 (2010).
- Kwon, B. K., Okon, E. B., Tsai, E., et al. A grading system to evaluate objectively the strength of pre-clinical data of acute neuroprotective therapies for clinical translation in spinal cord injury. J. Neurotrauma. 28, 1525-1543 (2011).
- Norenberg, M. D., Smith, J., Marcillo, A. The pathology of human spinal cord injury: defining the problems. J. Neurotrauma. 21, 429-440 (2004).
- Siegenthaler, M. M., Tu, M. K., Keirstead, H. S. The extent of myelin pathology differs following contusion and transection spinal cord injury. J. Neurotrauma. 24, 1631-1646 (2007).
- Talac, R., Friedman, J. A., Moore, M. J., et al. Animal models of spinal cord injury for evaluation of tissue engineering treatment strategies. Biomaterials. 25, 1505-1510 (2004).
- Tator, C. H. Review of treatment trials in human spinal cord injury: issues, difficulties, and recommendations. Neurosurgery. 59, 957-982 (2006).
