Summary
En kontusjon modell for alvorlig ryggmargsskade er beskrevet. Detaljerte pre-operative, operative og post-operative trinn beskrives for å oppnå en konsistent modell.
Abstract
Den translasjonell potensialet for nye behandlinger bør utredes alvorlig ryggmargsskade (SCI) contusion modeller. En detaljert metode er beskrevet for å oppnå en konsistent modell av alvorlig SCI. Bruk av en stereotaktisk ramme og datastyrte nedslaget gir mulighet for etablering av reproduserbar skade. Nedkjøling og urinveisinfeksjon utgjøre betydelige utfordringer i den postoperative perioden. Nøye oppfølging av dyr med daglig vekt opptak og blære uttrykk åpner for tidlig deteksjon av postoperative komplikasjoner. De funksjonelle resultatene av denne bloduttredelse modellen er ekvivalent med transection modeller. Den kontusjon Modellen kan brukes til å evaluere effekten av både nevrobeskyttende og neuroregenerative tilnærminger.
Introduction
Valg av riktig skade modellen er avgjørende for preklinisk evaluering av nye behandlinger for ryggmargsskade (SCI). 1,2,13 I en fersk undersøkelse av leger og forskere innen Neurotrauma contusion modell, i motsetning til hemisection eller komplette transection modeller , ble allment akseptert å være klinisk relevant. 8 Denne uttalelsen er basert på observasjonen om at flertallet av ryggmargsskade hos mennesker er contusive i naturen. ti biologi contusion synes også å være forskjellig fra hemisection eller transection modeller. 11. Iseda, et al. sammenlignet effekten av intraspinale kondroitinase ABC injeksjon på neuroregeneration separat i hemisection og contusion modeller. 4 aksonal regenerasjon ble observert i neuronal bro i hemisection men ikke contusion SCI gruppen. Den hemisection eller komplette transection modeller også legge forholdene kjent for å eksistere i bare en svært liten del av clinical omstendigheter. For eksempel har flere etterforskere ansatt stillas-baserte intervensjoner for implantasjon i lesjon hulrom etter hemisection eller fullstendig transection å fremme regenerering. 6 Denne tilnærmingen blir klinisk irrelevant fordi etableringen av et hulrom innenfor skadet ryggmarg er upraktisk og sannsynligvis uetisk.
Variasjon i funksjonelle utvinning er fortsatt en stor utfordring for de contusion modeller. 5,12 Denne variasjonen kan minimeres ved bruk av datastyrt nedslaget og stabilisering av ryggraden før virkningen for enhetlig kraft levering over hele ryggmargen volum spesielt ventrally plassert motor veier . Det må bemerkes at plastisitet og sivile bidrag fra overlevende axoner er den dominerende mekanismen for utvinning etter ryggmargsskade. 1 Derfor selv små variasjoner i contusion teknikken kan gi signifikant forskjellige resultater. Til dette formålet har vi utvikleten modell for alvorlig ryggmargsskade som er konsistent bloduttredelse volum og funksjonell restitusjon sammenlignbar med transection modeller. Denne modellen kan benyttes til å undersøke både neuroprotection og neuroregeneration strategier som en proof of concept for behandling effekt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Forberedelse Før ryggmargsskade
Den kirurgiske instrumenter som kreves for denne prosedyren er skalpell, pickups med og uten tenner, hemostats, selv støttemurer haker, fine tips Rongeurs, nål driver, absorberbare suturer, og huden klippet applikatorer. Andre kirurgiske forsyninger som kreves er operasjonsduker, sterile laken for kirurgiske feltet, gasbind svamper, bomull-tip påføring, og metallic folie. Autoklaver de kirurgiske instrumenter og utstyr før operasjonen. Bruk den enkelte sett av instrumenter og utstyr for ett dyr. Rengjør det kirurgiske området og apparater (nedslaget, lyskilde, stereotaktisk ramme, glass perle autoklaver, og varmere) med alkohol våtservietter.
Åpne operasjonsduker og bruk sterile hansker for å drapere den kirurgiske feltet nøye unngå forurensning. Åpne de enkelte instrumentene sterilely og nøye plassere de i det kirurgiske feltet. Dekk knotter og håndtak av the apparat sannsynligvis nødvendig under prosedyren med den sterile metallfolie. Switch-på glasset perle sterilisator å være klar til bruk i løpet av prosedyren.
2. Utarbeidelse av Dyr
Bring rottene til laboratoriet området noen time før selve prosedyren. Administrer smertestillende medikamenter i det minste en time forut for den forventede prosedyre (typisk buprinorphine 1,5 ml av 0,006 mg / ml subkutan). Administrer preoperativ antibiotika (typisk Baytril 4 mg / kg subkutant). Anesthetize rotter ved hjelp av 90 mg / kg ketamin og vente inntil det ikke tå-klemme respons. Palpate den mest fremtredende spinous prosess i thorax ryggraden. Dette nivået tilsvarer vanligvis med T10 spinous prosess. Markere plasseringen av beregnet nivå i forhold til T10. I vårt laboratorium utfører vi en T10 skade. Den følgende fortelling beskriver teknikken for T10 SCI. Barbere en 3 cm x 6 cm rektangel lengderetningen og sentrert på T10 nivå. Rengjør huden tre ganger with Betadine løsning. Påfør ophthalmic smøremiddel på hvert øye. Overfør rotte i en komfortabel stilling til det kirurgiske området nøye unngå forurensning. Sett inn en rektal temperatur probe for å overvåke kjernetemperaturen og justere varme tilsvarende for å holde dyr temperaturen så nær normal (~ 37,5 ° C) som mulig. Dekk rotte med en kirurgisk drapere med et vindu over operasjonsstedet.
3. Kirurgisk prosedyre
Begynn med en omtrentlig 4 cm snitt bruker en # 10 blad sentrert på T10 mark. Fortsett å tålmodig dissekere fascia og muskel lag bort fra T9-T11 spinous prosesser og lameller. Plasser sårhaker å trekke muskel og fascia bort fra benet. Mens stabilisere spinous prosessen med T9 kraftig dele interspinous ligament mellom T9 og T10 med gode saks. Tilsvarende stabilisere T10 spinous prosessen og dele interspinous ligament mellom T10-T11. Bruk sløyfe forstørrelse for å kompletterete delingen av leddbånd hele veien gjennom ligamentum flavum (figur 1). Den intraspinal sac er lett synlig når ligamentum flavum er frakoblet. Bruk fin spiss rongeurs å nøye utføre stykke måltid laminectomy bilateralt på T10. Ytterste forsiktighet er tatt for å unngå et press på intraspinal sac og utilsiktet skade fra rongeur tips. Lamina og spinous prosessen med T10 er helt fjernet.
Flytt dyret på plass på stabilisering plattform. Bruk stabiliserende klemmer å bremse den ryggraden ved å klemme den laterale aspekter av T11 ryggvirvel kroppen etterfulgt av den laterale aspekter av T9 ryggvirvel kroppen. Vær forsiktig så du ikke komprimere rotte inn i plattformen med de stabiliserende klemmer da dette ville begrense plass for respiratoriske bevegelser og legge uønsket stress dyret. Etter å ha sikret ryggsøylen innstillinger på datamaskinen-kontrollerte nedslaget er kontrollert. Vi bruker vanligvis impactor spissen av 3,0 mm på en speed av 4 cm / s med en dybde på 2 mm og en oppholdstid på 0,3 sek. Utvide nedslaget tips og senk den til den såvidt berører ledningen overflaten. Trekk inn tips og senke enheten 2 mm mot ryggmargen overflaten. Slipp stempelet på 4 cm / sek for å forårsake alvorlig contusion ryggmargsskade. Oppnå hemostase ved hjelp av bare nok trykk til å holde bomull-tip applikator på plass, være forsiktig for ikke å skape unødvendig press på ledningen. Sutur muskel og fascia lag med en figur-åtte sting være forsiktig med å trekke for stramt ved bruk av absorberbare suturer. Nær huden med et minimum av to små stifter, opptil fire eller fem stifter kan benyttes dersom deler av innsnittet være åpen etter at de første to eller tre stifter.
3. Post-prosedyre Care
Plasser rotter i et varmt miljø på ca 33-35 ° C i 24 timer etter operasjonen. Dette innebærer en inkubator (mens de er bevisstløs) og et oppvarmet bur plass når de begynner å bevege seg. Når rotter er fullt awake, administreres 5 ml saltløsning, 1,5 ml (0.006 mg / ml) av buprinorphine, og 0,1 ml av baytril alt subkutant. Fortsett med buprinorphine subkutant to ganger om dagen for første 24-48 timer og Baytril en gang om dagen i 7 dager. Blærer bør være manuelt uttrykt tre ganger daglig før retur av blærefunksjonen (<2 ml urin i tidlig morgen ekspresjon i 3 påfølgende dager). Dyr bør også sjekkes i løpet av denne tiden for infeksjon (blod i urinen, hvitaktig farge, eller vond lukt), redusert fysisk aktivitet eller problemer med sårtilheling. Tilstedeværelse av infeksjon bør motvirkes med økt dose (eller re-oppstart) av antibiotika i samråd med lokale veterinærer. Vei rotter daglig begynner dagen etter operasjonen for å vurdere deres utvinning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lesjon Volume
Vi har oppnådd store og konsistent lesjon volumer ved å følge den teknikk som er beskrevet ovenfor. Ved hjelp av en Luxol fort blå flekker en gjennomsnittlig lesjon volum på 2,04 mm 3 (95% KI 01.09 til 02.18) (n = 5 dyr) ble oppnådd. Figur 2 viser normalen lesjon volum med en representant flekker ved hjelp Luxol fort blå gjennom lesjon episenteret.
Funksjonelle Poeng
De atferdsmessige score målt ved Basso, Beattie, Bresnahan (BBB) skala er vist i figur 3.. Ved 12 uker rottene i kontrollgruppen oppnådde en gjennomsnittlig BBB score på 2,2 ± 1,1 (n = 10 dyr).
Andre parametere
Basert på vår nyeste erfaring med 32 dyr operasjoner overlevelsen av denne teknikken er 93,4%. Alle dødelighet var relatert til vedvarende urinveisinfeksjon (UVI) etterfulgt av dyr offer for å unngå overdreven smerte og lidelse. Etter endt kurs av antibiotika i 7 dager 16.7% dyrene utviklet UTI. Gjennomsnittlig antall dager for påvisning av UTI postoperativ var 14,6 ± 7,6 dager. Interessant dyrene oppnådd blærekontroll på en gjennomsnittlig 13 dager etter skaden (gjennomsnittlig 13,33 ± 3,6 dager). Rotter som utviklet UTI tok lengre tid å oppnå blærekontroll i forhold til rotter uten UTI (Blærekontroll i rotter med UTI - 16 ± 1 dager versus 12,8 ± 3,7 dager for blærekontroll hos rotter uten UTI, p = 0,03). I kohorten som oppnås blærekontroll innen 14 dager uten påfølgende UTI ble oppdaget. Som vist i figur 4, var det en første vinning i vekt etter SCI sannsynlig fra væskeretensjon. Vekten senere falt og stabilisert på et lavere nivå (ca. 10-12% lavere enn baseline) i ca 10 dager.
/ Files/ftp_upload/50111/50111fig1highres.jpg "/>
Figur 1. Ryggvirvel anatomi av rotte fra bakre tilnærming (til venstre) demonstrerer spinous prosesser og lameller. Plasseringen av ligamentum flavum (LF) er avbildet i mellomrommet mellom lamellene. Mid-saggital delen (til høyre) viser den relative plasseringen av ligamentum flavum og interspinous ligament i forhold til ryggmargen.
Figur 2. Søylediagram som viser lesjon volum (på 3 mm, Y-aksen) i dyr som fikk alvorlig ryggmargsskade (til venstre). Et representativt lengdesnitt gjennom skade skjelvenes etter Luxol rask blå farging (høyre).
g3highres.jpg "/>
Figur 3. Mener BBB (Y-aksen) score på rotter i løpet av tre måneders oppfølging (X-aksen) viser minimal utvinning typisk for alvorlig SCI.
Figur 4. Linje diagram som viser variasjon i daglig vekt (i g, y-aksen) rotter mer enn to ukers varighet (x-aksen) etter induksjon av ryggmargsskade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flere nye behandlinger har nylig vist tidlig løfte innen SCI forskning. Tre nøye vurdering av disse behandlingene er essensielt i klinisk relevant modell av SCI for å velge strategier med maksimal translasjons-potensial. En ordningen med gradering nylig ble utviklet for å vurdere styrken i prekliniske studier. 9 Ordningen understreket viktigheten av å utnytte contusion modell av alvorlig SCI. Her beskriver vi en slik contusion modell av alvorlig SCI med konsekvent lesjon volumer og funksjonelle score ligner de av transection modeller. Denne modellen kan brukes som et "bevis på konseptet 'for å etablere behandling effekt både for neurobeskyttelse og neuroregeneration strategier.
Den generasjonen av uniform contusive SCI fortsatt utfordrende. For reproduserbarhet, er det vesentlig at skaden utføres så ensartet som mulig. Den målrettet nivå i ryggmargen må identifiseres konsekvent frOM dyr til dyr. Fjerning av bein under laminectomy bør gjøres nøye for å sikre at ingen bein fragmenter er igjen i spinalkanalen, og disse kan forårsake kompresjon skader og introdusere uønskede variasjoner i skademekanismer og utvinning potensial. Vi har vedtatt flere tiltak for å sikre ensartethet inkludert størrelsen på nedslaget, stiv stabilisering av ryggraden på en ramme med montert stabiliserende armene, ved hjelp av en uniform innvirkning hastighet og dybde av forstoppelse. Det er viktig at den rotte sitte godt når de stabiliserende tangen klemmes til de vertebrale legemer. Eventuelle variasjoner i ryggradinnstilling eller overflødig stress under festebraketter kan endre biomekanikk av betydning. Vi brukte en 2,5 mm nedslaget siden den gjennomsnittlige størrelsen på rotte ryggmargen i vår region av interesse er 2,5-3 mm. Kontakten tid eller dvele ble jevnt satt til 0,3 sek i våre forsøk. Men i vår observasjon og rapporter fra andre laboratorier, for en alvorlig modell av SCI dybden av betydning er den mest avgjørendeparameter. I forsøkene beskrevet i dette papir virkningen ble levert med en konstant dybde på 2 mm. Andre faktorer som påvirker ensartethet inkluderer trening av personell, klar visualisering av vevet, og nedslaget tips for å sikre direkte innvirkning på ledningen vev (og ikke de benete strukturer).
Rottene bør være konstant observeres i løpet av prosedyren for nødvendige vitale tegn viktigst kjernetemperatur og åndedrettet. Hypotermi er den ledende årsaken til dødelighet under og umiddelbart etter anestesi administrasjon. Overvåking av kjernetemperatur med rektal probe og passende varmeputer vil unngå denne komplikasjonen. Dersom pusten blir uregelmessig eller dyret opphører å ånde, bør prosedyren umiddelbart stoppet inntil puste tilbake til utgangsverdien. Overdreven smerte og eller utilsiktet overdosering av smerte og bedøvelse medisiner kan også føre til pusteproblemer. Rottene bør overvåkes nøye etter prosedyren. Deres wåttere bør måles nøyaktig og tap av> 20% fra baseline vekt bør føre en gransking mat og vann inntak, urinveisinfeksjon, hudskader, post-SCI ileus, etc. Tidlig samråd med veterinær ansatte for utredning og behandling er avgjørende i slike situasjoner. Som diskutert tidligere, bør rotter som ikke har gjenvunnet blærekontroll etter dag 14 startes tilbake på antibiotika for å unngå en potensielt dødelig urinveisinfeksjon.
Ryggmargsskade kan være forårsaket av enten en forskyvning metode eller konstant kraft metoden. 5,12 Teknikken er beskrevet i denne artikkelen er fortrengning metode der kraften leveres til fast dybde i ryggmargen vev. Bruken av en datamaskin-styrt nedslaget tillater en grad av kontroll som ikke er oppnåelig ved de andre vanlige fremgangsmåter for eksperimentell SCI. Klippet komprimering teknikk tillater ikke for en sløv, contusive kraft med umiddelbar løslatelse, mens NYU innvirkningeller er avhengig av tyngdekraften for å bestemme styrken av bloduttredelse. Disse teknikkene selv reproduserbar, ikke tillater simulering av forholdene oppstått under et motorkjøretøy ulykke, den vanligste årsaken til akutt SCI hos mennesker. Tidligere studier har vist at skader alvorlighetsgraden er direkte korrelert med dybden av virkningen enn hastigheten av virkningen. Syv derfor denne modellen gir mulighet for en alvorlig SCI for å bli rutinemessig utført med mulighet for å modifisere graden gjennom et større utvalg av kombinasjoner av kraft og forskyvning .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Kvartalsrapporten none
Finansiering avsløring ingen.
Acknowledgments
Forfatterne er takknemlige til Dr. N. Banik og Dr. D. Mitchell for deres veiledning i utviklingen av denne modellen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computer controlled impactor | Leica or the Infinite Horizons (formerly OSU) impactor | ||
| Surgical instruments | |||
| Scissors | Fine Science Tools Inc | 14094-11 or 14060-09 | |
| Forceps | Fine Science Tools Inc | 11006-12 and 11027-12 or 11506-12 | |
| Hemostats | Fine Science Tools Inc | 13009-12 | |
| Retractors | Fine Science Tools Inc | 17011-10 | |
| Rongeurs | Fine Science Tools Inc | 16020-14 | |
| Needle driver | Fine Science Tools Inc | 12001-13 | |
| Stereotactic frame | Leica or RWD Life Science Co. or TSE systems | ||
| Buprinorphine | |||
| Baytril | Bayer | ||
| Ketamine | |||
References
- Blesch, A., Tuszynski, M. H. Spinal cord injury: plasticity, regeneration and the challenge of translational drug development. Trends Neurosci. 32, 41-47 (2009).
- Dobkin, B. H. Curiosity and cure: translational research strategies for neural repair-mediated rehabilitation. Dev. Neurobiol. 67, 1133-1147 (2007).
- Fehlings, M. G., Cadotte, D. W., Fehlings, L. N. A series of systematic reviews on the treatment of acute spinal cord injury: a foundation for best medical practice. J. Neurotrauma. 28, 1329-1333 (2011).
- Iseda, T., Okuda, T., Kane-Goldsmith, N., et al. Single, high-dose intraspinal injection of chondroitinase reduces glycosaminoglycans in injured spinal cord and promotes corticospinal axonal regrowth after hemisection but not contusion. J. Neurotrauma. 25, 334-349 (2008).
- Khan, T., Havey, R. M., Sayers, S. T., et al. Animal models of spinal cord contusion injuries. Laboratory Animal Science. 49, 161-172 (1999).
- Kim, B. G., Kang, Y. M., Phi, J. H., et al. Implantation of polymer scaffolds seeded with neural stem cells in a canine spinal cord injury model. Cytotherapy. 12, 841-845 (2010).
- Kim, J. H., Tu, T. W., Bayly, P. V., et al. Impact speed does not determine severity of spinal cord injury in mice with fixed impact displacement. Journal of Neurotrauma. 26, 1395-1404 (2009).
- Kwon, B. K., Hillyer, J., Tetzlaff, W. Translational research in spinal cord injury: a survey of opinion from the SCI community. J. Neurotrauma. 27, 21-33 (2010).
- Kwon, B. K., Okon, E. B., Tsai, E., et al. A grading system to evaluate objectively the strength of pre-clinical data of acute neuroprotective therapies for clinical translation in spinal cord injury. J. Neurotrauma. 28, 1525-1543 (2011).
- Norenberg, M. D., Smith, J., Marcillo, A. The pathology of human spinal cord injury: defining the problems. J. Neurotrauma. 21, 429-440 (2004).
- Siegenthaler, M. M., Tu, M. K., Keirstead, H. S. The extent of myelin pathology differs following contusion and transection spinal cord injury. J. Neurotrauma. 24, 1631-1646 (2007).
- Talac, R., Friedman, J. A., Moore, M. J., et al. Animal models of spinal cord injury for evaluation of tissue engineering treatment strategies. Biomaterials. 25, 1505-1510 (2004).
- Tator, C. H. Review of treatment trials in human spinal cord injury: issues, difficulties, and recommendations. Neurosurgery. 59, 957-982 (2006).
