Summary
Контузии модели тяжелых травм спинного мозга описывается. Подробные дооперационной, оперативное и послеоперационные шаги описаны для получения согласованной модели.
Abstract
Поступательное потенциал новых методов лечения должна быть исследована в тяжелых травм спинного мозга (SCI) ушиб моделей. Подробная методика описана получить непротиворечивую модель тяжелого ТСМ. Использование стереотаксической рамы и компьютерным управлением позволяет ударный для создания воспроизводимых травмы. Переохлаждения и инфекций мочевыводящих путей создают серьезные проблемы в послеоперационный период. Тщательный мониторинг животных с ежедневной записи веса и мочевого пузыря позволяет выражения для раннего выявления послеоперационных осложнений. Функциональные результаты этого ушиб модели эквивалентны пересечение моделей. Ушиб модель может быть использована для оценки эффективности и нейропротекторное и neuroregenerative подходов.
Introduction
Выбор подходящей модели травма имеет решающее значение для доклинической оценки новых методов лечения травм спинного мозга (SCI). 1,2,13 В ходе недавнего опроса врачей и ученых в области ушиба нейротравме модель, в отличие от гемисекция или полной модели перерезки , было общепринятым, чтобы быть клинически значимым. 8 Это мнение основано на наблюдении, что большинство травм спинного мозга у людей contusive в природе. +10 биология контузию также, кажется, отличается от гемисекция или перерезка моделей. Iseda 11, ET ал. сравнивали эффективность интраспинальной инъекции хондроитиназы на нейрорегенерации отдельно в гемисекция и ушиб моделей. 4 регенерацию аксонов наблюдали в нейронную моста в гемисекция но не группы ушиб ТСМ. Гемисекция или полной модели перерезки также создать условия известно, существуют лишь в очень небольшой части CLinical обстоятельствах. Например, некоторые исследователи использовали эшафот мероприятия, направленные на имплантации в полость после поражения гемисекция или полной перерезки содействовать регенерации. 6 Этот подход становится клинически имеет значения, поскольку создание полости в поврежденный спинной мозг непрактично и, возможно, неэтично.
Изменчивость функциональное восстановление остается важнейшей задачей для контузии моделей. 5,12 Эта изменчивость может быть сведена к минимуму за счет использования управляемых компьютером ударника и стабилизация позвоночника перед ударом для единой системы оказания силу через спинной объем шнура особенно снизу расположены путей двигателя . Следует отметить, что пластичность и залог вклада от сохранившихся аксонов является преобладающим механизмом восстановления после травмы спинного мозга. 1 Поэтому даже незначительные изменения в технике ушиб может дать весьма различные результаты. С этой целью мы разработалимодель тяжелой травмы спинного мозга, который дает постоянный объем и ушиб функционального восстановления сравнимы с перерезки моделей. Эта модель может быть использована для исследования как нейропротекции и нейрорегенерации стратегии как доказательство концепции эффективности лечения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка Перед Травма спинного мозга
Хирургические инструменты необходимые для этой процедуры являются скальпель, пикапы с и без зубов, кровоостанавливающие, самостоятельно сохраняя преднатяжителями, Изысканные Rongeurs наконечник, игла водитель, рассасывающиеся нити, и аппликаторы кожи клип. Другие хирургические принадлежности требуются хирургические простыни, стерильные листы для операционного поля, марлевые тампоны, хлопок наконечником аппликаторы и металлической фольги. Автоклав хирургических инструментов и принадлежностей до операции. Используйте индивидуальный набор инструментов и принадлежностей для одного животного. Очистите хирургической области и аппаратура (ударный, источник света, стереотаксической рамке, стеклянная бусина стерилизаторы, и грелки) спиртовыми салфетками.
Откройте хирургических простыней и использовать стерильные перчатки, чтобы драпировать операционного поля тщательно избегая загрязнения. Откройте отдельных инструментов стерильно и аккуратно поместить эти в операционном поле. Накройте Ручки йэлектронный аппарат всего необходимы во время процедуры со стерильным металлической фольги. Включение стерилизатора стеклянная бусина, чтобы быть готовым для использования во время процедуры.
2. Подготовка животных
Доведите крыс в лабораторию область несколько часов до фактической процедурой. Администрирование обезболивающее по крайней мере один час впереди ожидается процедуры (обычно buprinorphine 1,5 мл 0,006 мг / мл подкожно). Администрирование предоперационной антибиотиков (обычно Baytril 4 мг / кг подкожно). Обезболить крысах с использованием 90 мг / кг кетамина и подождите, пока нет ног щепотку ответа. Пропальпируйте самых известных остистые отростки в грудном отделе позвоночника. Этот уровень обычно соответствует T10 с остистым отростком. Отметьте место предполагаемого уровня по отношению к T10. В нашей лаборатории мы проводим T10 травмы. Следующие рассказ описывает технику T10 ТСМ. Бритье 3 см х 6 см в продольном направлении и прямоугольник с центром в T10 уровне. Очистите кожу три раза WiРешение й Бетадин. Применить офтальмологических смазки на каждый глаз. Передача крыса в удобное положение для операционного поля тщательно избегая загрязнения. Вставка ректальный зонд температуры для контроля внутренней температуры и регулировки нагрева соответственно держать животных температуре, близкой к нормальной (~ 37,5 ° С), как это возможно. Накройте крысы с хирургической простыне с окном выше места операции.
3. Хирургическая процедура
Начните с приблизительным 4 см разрез с помощью лезвия № 10 с центром в знак T10. Перейдите к терпеливо рассекают фасции и мышечные слои от T9-T11 остистые отростки и пластинки. Наведите преднатяжителями отказаться мышцы и фасции от кости. В то время как стабилизация остистого отростка Т9 резко разделить межостистой связки между T9 и T10 с использованием тонких ножниц. Аналогично стабилизации T10 остистого отростка и разделить межостистой связки между T10-T11. Используйте петли увеличение до дополнятьTE разделение связок весь путь до конца желтой связки (рис. 1). Гнойный мешок легко просматривается только желтой связки отключено. Используйте тонкий наконечник Rongeurs тщательно выполнять частям ламинэктомией двустороннем уровне Т10. Предельная осторожность, чтобы избежать понижательное давление на дурального мешка и непреднамеренные травмы от костными кусачками советы. Пластинки и остистым отростком T10 полностью удаляется.
Перемещение животных в положение на стабилизацию платформы. Используйте стабилизирующие зажимы для иммобилизации позвоночника путем закрепления боковых аспекты T11 тела позвонка последующим боковым аспекты T9 тела позвонка. Будьте осторожны, чтобы не сжимать крысу в платформу со стабилизирующим зажимы, как это будет ограничивать пространство для дыхательных движений и добавить нежелательных стрессов животного. После обеспечения спинного настройки колонке с компьютерным управлением ударный проверяются. Обычно мы используем ударный кончика 3,0 мм при SPEed 4 см / с с глубиной 2 мм и время задержки 0,3 сек. Расширение ударный наконечник и снизить его, пока он не коснется поверхности шнура. Уберите кончик и опустите устройства 2 мм в сторону поверхности спинного мозга. Отпустите поршня в 4 см / сек, вызывают тяжелые контузии травмы спинного мозга. Достичь гемостаза, используя только достаточно давления, чтобы держать хлопка-аппликатор на место, соблюдая осторожность, чтобы не создавать ненужного давления на мозг. Мышцы и фасции шовный слоев с цифры 8 стежков стараясь не тянуть слишком туго использованием рассасывающиеся нити. Закройте кожи с минимумом 2 небольшие скобы; до 4 или 5 скобы могут быть использованы, если части разреза остаются открытыми после первых 2 или 3 скоб.
3. После процедуры ухода
Место крыс в теплом помещении около 33-35 ° С в течение 24 ч после операции. Это влечет за собой инкубатор (в то время как они являются бессознательными) и отапливаемых помещений клетку, как только они начинают двигаться. Как только крысы полностью AWAKE, администрирование 5 мл физиологического раствора, 1,5 мл (0,006 мг / мл) buprinorphine, и 0,1 мл подкожно Baytril все. Продолжайте buprinorphine подкожно два раза в день в течение первых 24-48 ч и Baytril один раз в день в течение 7 дней. Баллоны должны быть вручную выражены три раза в день до возвращения функции мочевого пузыря (<2 мл мочи в начале выражение утро в течение 3 последовательных дней). Животные также должны быть проверены в течение этого времени на инфекции (кровь в моче, беловатого цвета, или неприятный запах), снижение физической активности или проблемы с заживлением раны. Наличие инфекции следует бороться с повышенной дозировке (или повторного посвящения) антибиотиков в консультации с местными ветеринарами. Взвешивание крыс в день, начиная следующий день после операции, чтобы оценить их восстановления.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Объем повреждения
Мы получили большие объемы и последовательного поражения, следуя методике, описанной выше. Использование Luxol быстро синего окрашивания средний объем поражения 2,04 мм 3 (95% ДИ 1.9-2.18) (N = 5 животных) был получен. Рисунок 2 показывает среднюю объема поражения с представителем окрашивания с использованием быстрых Luxol синего через поражения эпицентра.
Функциональные результаты
Поведенческие оценки, как измеряется Бассо, Битти, Bresnahan (BBB) масштабе показаны на рисунке 3. Через 12 недель крыс в контрольной группе достигнут средний балл BBB 2,2 ± 1,1 (п = 10 животных).
Другие параметры
Основываясь на нашем опыте последних 32 операциях с животными выживаемость этого метода является 93,4%. Все смертности были связаны с хронической инфекцией мочевых путей (ИМП), а затем жертву животных, чтобы избежать чрезмерная боль и страдания. После завершения курса антибиотиков в течение 7 дней 16,7% животных развивались ИМП. Среднее число дней для выявления ИМП послеоперационные составила 14,6 ± 7,6 дней. Интересно животных достигается контроль над мочевым пузырем в среднем через 13 дней после травмы (в среднем 13,33 ± 3,6 дней). Крысы, которые разработали ИМП заняло больше времени для достижения контроля мочевого пузыря по сравнению с крысами без ИМП (контроль мочевого пузыря у крыс с ИМП - 16 ± 1 дней против 12,8 ± 3,7 дней для контроля мочевого пузыря у крыс без ИМП, р = 0,03). В когорте, что достигается контролем мочевого пузыря в течение 14 дней никакие последующие ИМП не обнаружено. Как показано на рисунке 4, была первоначальная прибыль в весе после SCI вероятно, задержке жидкости. Вес впоследствии снизилось и стабилизировалось на более низкий уровень (примерно на 10-12% ниже, чем исходный уровень) в примерно 10 дней.
/ Files/ftp_upload/50111/50111fig1highres.jpg "/>
Рисунок 1. Позвоночных анатомии крысы из заднего доступа (слева) демонстрирует остистые отростки и пластинки. Положение желтой связки (LF) изображен в пространство между пластинками. Средний сагиттальной разделе (справа) показывает относительное положение желтой связки и межостистой связки по отношению к спинному мозгу.
Рисунок 2. Гистограмма, показывающая объем повреждения (в мм 3, Y оси) у животных, получавших тяжелые травмы спинного мозга (слева). Представитель продольный разрез после травмы эпицентре Luxol быстро синего окрашивания (справа).
g3highres.jpg "/>
Рисунок 3. Среднее BBB (ось у) Оценка крыс в течение 3 мес наблюдения (ось Х) демонстрируют минимальное восстановление типичных тяжелых ТСМ.
Рисунок 4. Линия схему, показывающую изменение ежедневный вес (в г, Y оси) крыс в течение 2 недель продолжительность (ось Х) после индукции повреждения спинного мозга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Несколько лечения роман недавно показали ранние обещания в области исследования ТСМ. 3 Тщательная оценка этих методов лечения имеет важное значение в клинически значимой модели SCI для выбора стратегии с максимальной поступательного потенциал. Схема классификации Недавно был разработан для оценки силы доклинических исследований. 9 Эта схема подчеркнул важность использования модели ушиба тяжелой ТСМ. Здесь мы опишем такие модели ушиба тяжелой SCI с последовательным объемах поражения и функциональной оценки, напоминающие перерезки моделей. Эта модель может быть использована в качестве "доказательство концепции", чтобы установить эффективность лечения, как для нейропротекции и нейрорегенерации стратегий.
Моделирование равномерного contusive SCI остается сложной. Для воспроизводимости, важно, что травма быть выполнены как можно более равномерно. Целевого уровня спинного мозга должны быть определены последовательно FROM животного к животному. Удаление костей при ламинэктомией должно быть сделано аккуратно, чтобы убедиться в отсутствии костных фрагментов не осталось в спинномозговой канал; это может привести компрессионной травмой и ввести нежелательные изменения в механизмах травмы и восстановления потенциала. Мы приняли ряд мер для обеспечения единообразия в том числе размер ударный, жесткая стабилизация позвоночника на раме с установленными стабилизирующим оружия, используя единую скорость удара и глубину столкновение. Важно, что у крысы быть расположены удобно, когда стабилизирующий щипцы, чтобы совпасть с телами позвонков. Любые изменения в спинном выравнивание или лишнее напряжение при зажиме может изменить биомеханику удара. Мы использовали 2,5 мм ударный поскольку средний размер спинного мозга крысы в нашей области, представляющей интерес в 2,5-3 мм. Время контакта или остановиться равномерно установлены на 0,3 сек в наших экспериментах. Однако в наших наблюдений и отчетов других лабораториях, для тяжелых модель SCI глубину воздействия является наиболее важнымпараметра. В экспериментах, описанных в этой статье воздействие было доставлено на постоянной глубине 2 мм. Другие факторы, влияющие на однородность включает обучение персонала, четкой визуализации тканей и ударный жала, чтобы обеспечить непосредственное влияние на шнуре ткань (а не костные структуры).
Крысы должны постоянно наблюдать во время процедуры необходимые для жизненно важных главное внутреннюю температуру и дыхание. Гипотермия является ведущей причиной смертности во время и сразу после наркоза администрации. Мониторинг температуры ядра с ректального датчика и соответствующего грелки позволит избежать этого осложнения. Если дыхание становится нерегулярным или животное перестает дыхание, процедура должна быть немедленно прекращена до тех пор дыхание возвращается к базовой линии. Чрезмерное боли и или случайного передозировки боли и обезболивающий препарат также может привести к проблемам с дыханием. Крысы должны тщательно контролироваться после процедуры. Их WВосьмерки должны быть измерены точно и потери> 20% от исходного веса должно побудить расследование пищи и воды, инфекции мочевыводящих путей, повреждения кожи, после SCI кишечной непроходимости и т.д. Ранние консультации с ветеринарного персонала для обследования и лечения имеет решающее значение в таких ситуациях. Как обсуждалось ранее, крысы, которые не были восстановлены контроля мочевого пузыря к 14 дню должен быть запущен снова антибиотики, чтобы избежать потенциально смертельную инфекцию мочевыводящих путей.
Травма спинного мозга может быть вызвана либо методом перемещения или метода постоянной силы. 5,12 методике, описанной в этой статье, где методом смещения силы завозится к определенной глубине в ткани спинного мозга. Использование управляемых компьютером ударный позволяет уровень контроля, которой нет еще на другие общие методы экспериментальной ТСМ. Техника сжатия клипа не позволяет тупым, contusive силу с немедленного освобождения, в то время как влияние NYUили зависит от тяжести для определения силы ушиба. Эти методы, хотя воспроизводимым, не позволяет имитировать условия, возникшие в ходе дорожно-транспортного происшествия, наиболее распространенной причиной острой ТСМ в людях. Предыдущие исследования показали, что степень тяжести ранения напрямую коррелирует с глубиной воздействия, чем скорость удара. 7 Поэтому эта модель позволяет тяжелой SCI будет регулярно проводится с потенциалом, чтобы изменить тяжесть через более широкий диапазон комбинаций сил и перемещений .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Финансовые никто не раскрытия
Ни один Финансирование раскрытия.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность д-р Н. Баник и д-р Д. Митчелл для их руководства при разработке этой модели.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computer controlled impactor | Leica or the Infinite Horizons (formerly OSU) impactor | ||
| Surgical instruments | |||
| Scissors | Fine Science Tools Inc | 14094-11 or 14060-09 | |
| Forceps | Fine Science Tools Inc | 11006-12 and 11027-12 or 11506-12 | |
| Hemostats | Fine Science Tools Inc | 13009-12 | |
| Retractors | Fine Science Tools Inc | 17011-10 | |
| Rongeurs | Fine Science Tools Inc | 16020-14 | |
| Needle driver | Fine Science Tools Inc | 12001-13 | |
| Stereotactic frame | Leica or RWD Life Science Co. or TSE systems | ||
| Buprinorphine | |||
| Baytril | Bayer | ||
| Ketamine | |||
References
- Blesch, A., Tuszynski, M. H. Spinal cord injury: plasticity, regeneration and the challenge of translational drug development. Trends Neurosci. 32, 41-47 (2009).
- Dobkin, B. H. Curiosity and cure: translational research strategies for neural repair-mediated rehabilitation. Dev. Neurobiol. 67, 1133-1147 (2007).
- Fehlings, M. G., Cadotte, D. W., Fehlings, L. N. A series of systematic reviews on the treatment of acute spinal cord injury: a foundation for best medical practice. J. Neurotrauma. 28, 1329-1333 (2011).
- Iseda, T., Okuda, T., Kane-Goldsmith, N., et al. Single, high-dose intraspinal injection of chondroitinase reduces glycosaminoglycans in injured spinal cord and promotes corticospinal axonal regrowth after hemisection but not contusion. J. Neurotrauma. 25, 334-349 (2008).
- Khan, T., Havey, R. M., Sayers, S. T., et al. Animal models of spinal cord contusion injuries. Laboratory Animal Science. 49, 161-172 (1999).
- Kim, B. G., Kang, Y. M., Phi, J. H., et al. Implantation of polymer scaffolds seeded with neural stem cells in a canine spinal cord injury model. Cytotherapy. 12, 841-845 (2010).
- Kim, J. H., Tu, T. W., Bayly, P. V., et al. Impact speed does not determine severity of spinal cord injury in mice with fixed impact displacement. Journal of Neurotrauma. 26, 1395-1404 (2009).
- Kwon, B. K., Hillyer, J., Tetzlaff, W. Translational research in spinal cord injury: a survey of opinion from the SCI community. J. Neurotrauma. 27, 21-33 (2010).
- Kwon, B. K., Okon, E. B., Tsai, E., et al. A grading system to evaluate objectively the strength of pre-clinical data of acute neuroprotective therapies for clinical translation in spinal cord injury. J. Neurotrauma. 28, 1525-1543 (2011).
- Norenberg, M. D., Smith, J., Marcillo, A. The pathology of human spinal cord injury: defining the problems. J. Neurotrauma. 21, 429-440 (2004).
- Siegenthaler, M. M., Tu, M. K., Keirstead, H. S. The extent of myelin pathology differs following contusion and transection spinal cord injury. J. Neurotrauma. 24, 1631-1646 (2007).
- Talac, R., Friedman, J. A., Moore, M. J., et al. Animal models of spinal cord injury for evaluation of tissue engineering treatment strategies. Biomaterials. 25, 1505-1510 (2004).
- Tator, C. H. Review of treatment trials in human spinal cord injury: issues, difficulties, and recommendations. Neurosurgery. 59, 957-982 (2006).
