Summary
重度の脊髄損傷の挫傷モデルが記載されている。詳細、術前手術と術後の手順は一貫したモデルを得るために説明されています。
Abstract
小説の治療の並進ポテンシャルは厳しい脊髄損傷（SCI）挫傷モデルで調査する必要があります。詳細な方法は重度のSCIの一貫したモデルを得ることが記載されている。定位フレームとコンピュータ制御のインパクタを使用することにより、再現性の傷害の作成が可能になります。低体温症と尿路感染症は、術後の期間に重要な課題を提起。毎日の体重記録と膀胱表情を持つ動物の注意深い監視が術後合併症の早期発見が可能になります。この挫傷モデルの機能的な結果は、離断モデルと同等です。挫傷モデルは、神経保護及び神経再生両方のアプローチの有効性を評価するために利用することができる。
Introduction
適切な損傷モデルの選択は、脊髄損傷のための新たな治療法（SCI）の前臨床評価のために重要です。医師や神経外傷挫傷モデルの分野における科学者の最近の調査では、1,2,13、片側切断または完全離断モデルとは対照的に、 、普遍的に臨床的に関連のあることが受け入れられた。8この意見は、ヒトの脊髄損傷の大部分が自然の中で打撲であるという観察に基づいている。10挫傷の生物学は、また片側切断または離断モデルとは異なるように見えます。11 Iseda らはらは片側切断及び挫傷モデルで別々に神経再生に脊髄コンドロイチナーゼABC注射の効果を比較した4軸索再生が片側切断におけるニューロンの橋ではなく、挫傷SCI群で観察された。片側切断または完全な横断モデルもCLのごく小さなサブセットに存在することが知られている条件を作成するinical状況。たとえば、複数の研究者が片側切断または再生を促進するための完全な離断後に病変空洞内に注入するための足場ベースの介入を採用しました。6負傷脊髄内の空洞の作成 は非現実的で、おそらく非倫理的であるため、このアプローチは、臨床的には無関係になります。
機能回復にばらつきが挫傷モデルの主要な課題である。5,12このばらつきは、脊髄ボリューム全体で均一な力の配信のためのインパクトは特に腹側に位置する運動経路の前にコンピューター制御のインパクと背骨の安定化を使用することによって最小限に抑えることができます。それは生き残った軸索からの可塑性と担保貢献は脊髄損傷後の回復の主なメカニズムであることに注意しなければならない。挫傷技法で1したがって些細なバリエーションが大幅に異なる結果をもたらす可能性があります。この目的を達成するために、我々は開発してきた一貫挫傷量と離断モデルと同等の機能回復をもたらす深刻な脊髄損傷のモデル。このモデルは、治療効果の概念の証拠として、神経保護及び神経再生戦略の両方を調査するために利用され得る。
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Protocol
1。脊髄損傷前の準備
この手順に必要な手術器具は、歯とないメス、ピックアップ、止血、自己保持リトラクター、細かい先端骨鉗子、針ドライバ、吸収性縫合糸、皮膚クリップアプリケーターです。必要な他の手術用品外科用ドレープ、手術野のための無菌シーツ、ガーゼスポンジ、綿チップアプリケーター、及び金属箔である。手術の前に手術器具や消耗品をオートクレーブ。一匹のための機器および消耗品の個々のセットを使用します。アルコールワイプで手術領域および装置（インパク、光源、定位フレーム、ガラスビーズ滅菌、加熱パッド）を清掃してください。
外科用ドレープを開き、慎重に汚染を回避手術野をドレープに滅菌手袋を使用しています。無菌個々の楽器を開き、慎重に手術野のものを配置します。番目のノブやハンドルカバー電子装置は、おそらく無菌の金属箔との手順の実行中に必要としていました。スイッチオンガラスビーズ滅菌手順中に使用可能な状態になるように。
2。動物の作製
実際の手順の前に研究室エリア少ない時間にラットを持参。前もって予想手順（通常0.006 mg / mlの皮下のbuprinorphine 1.5ミリリットル）の少なくとも1時間鎮痛薬を管理します。術前の抗生物質（通常はバイトリル4 mg / kgを皮下）を管理。ケタミンの90 mg / kg体重を使ってラットを麻酔しないつま先ピンチ応答がなくなるまで待つ。胸椎で最も著名な棘突起を触診する。このレベルは、通常、T10棘突起に対応しています。 T10との関係で意図されたレベルの位置をマークします。私たちの研究室では、T10けがを実行します。次の物語は、T10 SCIの技術が記載されている。縦3センチメートル×6センチの長方形を剃るとT10のレベルを中心。清潔な肌三回のWi番目ベタジンソリューション。それぞれの目に眼科潤滑剤を適用します。慎重に汚染を回避手術野に楽な姿勢でラットを転送します。コア温度を監視し、正常に近い（〜37.5℃）できるだけのような動物の温度を保つためにそれに応じて加熱を調節するために直腸の温度プローブを挿入します。手術部位上記のウィンドウで外科用ドレープとラットをカバーしています。
3。外科手術
T10マークを中心に＃10のブレードを使用して近似横4cm切開で始まる。辛抱強く離れT9-T11棘突起と薄層から筋膜と筋肉層を解剖に進みます。骨から筋肉や筋膜を離れて撤回するトラクターを配置します。 T9の棘突起を安定しながら鋭く細かいハサミを使用してT9とT10の間に棘靭帯を分ける。同様にT10棘突起を安定させ、T10-T11の間に棘靭帯を分ける。補完するために、ループ倍率を使用黄色靱帯（ 図1）を介してTE靭帯の部門はすべての方法。黄色靱帯が切断された後莢膜嚢は容易に明らかである。慎重にT10で両側ピース食事椎弓切除を実行するために細い先端骨鉗子を使用してください。細心の注意は、骨鉗子先端から莢膜嚢と不注意傷害に下向きの圧力を避けるために取られる。ラミナとT10の棘突起が完全に削除されます。
安定化プラットフォーム上の位置に動物を移動します。 T9椎体の左右側面に続いT11椎体の横方向の側面をクランプして背骨を固定する安定クランプを使用してください。これは呼吸の動きのためのスペースを制限し、不必要なストレスを動物を追加しますと安定クランプでプラットフォームにラットを圧縮しないように注意してください。コンピュータ制御のインパクタで脊柱の設定を固定した後にチェックされます。我々は一般的に、SPで3.0ミリメートルのインパクチップを使用2mmの深さと0.3秒の滞留時間で4センチメートル/秒のEED。インパクチップを拡張し、それだけで脊髄表面に触れるまでそれを下げる。先端を撤回し、脊髄表面に向かってデバイス2ミリメートルを下げる。重度の挫傷、脊髄損傷を引き起こすために、4センチメートル/秒の速度でピストンを離します。コードの上に不要な圧力を作成しないように注意しながら、所定の位置に綿チップアプリケーターを維持するだけの十分な圧力を使って止血を達成。 8の字ステッチがきつすぎる使って吸収性縫合糸を引っ張らないように注意してとの縫合の筋肉と筋膜層。 2つの小さなステープルの最小値で皮膚を閉じ、切開部の一部が第2又は3のステープル後に開いたままにする場合、最大4または5のステープルを使用することができる。
3。術後ケア
24時間後の手術のため、約33-35°Cの暖かい環境で場所ラット。彼らが移動し始めたら、これがインキュベーター（彼らは無意識でありながら）、加熱されたケージのスペースを必要とする。かつてラットは完全にAWですAKEは、すべての皮下に生理食塩水5mlの、buprinorphine 1.5mlの（0.006 mg / ml）であり、バイトリルの0.1ミリリットルを投与。 1日1回7日間最初の24〜48時間とバイトリルため皮下一日二回buprinorphineに進みます。膀胱を手動膀胱機能のリターン（3日間連続早朝式で尿の<2ミリリットル）まで一日三回を表明すべきである。動物も感染症（尿中の血液、白っぽい色、または悪臭）、この時間中にチェックされるべきであり、創傷治癒と身体活動や問題を減少させた。感染症の存在は地元の獣医師と相談の上、抗生物質の投与量が増加（または再起動）で対抗すべきである。毎日彼らの回復を評価するために、手術の翌日から始まるラットの重量を量る。
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Representative Results
病変ボリューム
私たちは、技術は、上記に従うことによって大規模かつ一貫性のある病変のボリュームを取得しています。 2.04ミリメートル3（1.9から2.18 95％CI）（N = 5匹）の平均病変容積が得られたルクソールファストブルー染色を用いて、図2に示すと、病変震源を通してルクソールファストブルーを使用して代表的な染色で病変ボリュームを意味します。
機能的なスコア
バッソ、ビーティー、ブレスナハン（BBB）スケールで測定した行動スコアは、 図3に示されている。 12週の時点でコントロール群のラットは2.2±1.1（N = 10匹）の平均BBBスコアを達成しました。
その他のパラメータ
32動物の手術との私達の最も最近の経験に基づいて、この手法の生存率は93.4パーセントです。すべての死亡を回避するために、動物の犠牲が続く持続性の尿路感染症（UTI）に関連していた過度の痛みと苦しみ。 7日間抗生物質のコースを終えた後16.7％の動物がUTIを開発しました。 UTIの術後の検出のための日数の平均数は14.6±7.6であった日。興味深い動物が（13.33±3.6日の平均）損傷後平均13日に膀胱の制御を達成した。 UTIを開発したラットは、UTIなしラット（ - 16±12.8対1日数±UTI、P = 0.03せずにラットの膀胱制御のための3.7日UTIとラットの膀胱コントロール）に比べて、膀胱の制御を達成するために長い時間を要した。 14日以内に膀胱の制御を達成したコホートでは後続のUTIは検出されなかった。 図4に示すように、体液貯留可能性が高いからSCI後の重量で初期ゲインがあった。重量はその後削除され、約10日の下位レベル（ベースラインよりも約10から12パーセント以下）に安定した。
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図1。棘突起と薄層を示す後方アプローチ（左）から、ラットの椎骨解剖。黄色靱帯（LF）の位置が薄層との間の空間に描かれている。黄色靱帯と脊髄の関係で棘靭帯の相対的な位置を示すミッド矢状セクション（右）。
図2。重度の脊髄損傷（左）を受けた動物の病変体積（mmの3で、Y軸）を示す棒グラフ。ルクソール速いブルー染色（右）の後に傷害震源を通じて代表縦断。
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図3。重度のSCIの代表的な最低限の回収を実証するフォローアップ3ヶ月のコース（X軸）上にラットのBBB（Y軸）のスコアを意味します。
図4。脊髄損傷誘発後2週間の持続時間（X軸）上のラットの毎日の重量（g、Y軸）の変化を示す線図である。
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Discussion
いくつかの新規治療法が最近SCI研究の分野における初期の約束を示している。これらの治療法の3は十分な評価が最大の翻訳可能性のある戦略を選択するためにSCIの臨床的に関連するモデルでは必須である。グレーディングのスキームは、最近、前臨床試験の強度を評価するために開発されました。9このスキームは厳しいSCIの挫傷モデルを活用することの重要性を強調した。ここでは、一貫性のある病変ボリュームと離断モデルのものに似ている機能的なスコアと厳しいSCIのような挫傷モデルを記述する。このモデルは、両方の神経保護及び神経再生戦略のための治療有効性を確立するために "概念実証"として利用することができる。
制服挫傷SCIの生成が困難なままである。再現性のために、それは損傷はできるだけ均一に行うことが不可欠である。脊髄のターゲットレベルは一貫してFR識別されなければならない動物にOM動物。椎弓切除術時の骨の除去は全く骨片が脊柱管に残っていないことを確認するために慎重に行う必要があり、これらは圧縮の傷害を引き起こし、傷害メカニズムと回復可能性の不要なバリエーションをご紹介することができます。私たちは、宿便の均一な衝突速度と深さを使用して、マウントされた安定化腕をフレームに、背骨の剛性安定化をインパクターのサイズを含む均一性を確保するために、いくつかの手順を採用しています。それは安定鉗子が椎体に固定されている場合ラット快適に位置決めすることが重要である。クランプ時に脊椎アライメントや過剰ストレスのどのバリエーションがインパクトの生体力学を変更することがあります。興味のある我々の地域でのラット脊髄の平均サイズは2.5〜3ミリメートルであるため、我々は2.5ミリメートルインパクターを使用していました。接触時間又は滞留時間を均一に我々の実験では0.3秒とした。しかし我々の観察や他のラボからの報告では、SCIの厳しいモデルの影響の深さは最も重要ですパラメータ。本稿で述べた実験で影響は2mmの一定の深さで提供されていました。均一性に影響を与えるその他の要因には、臍帯組織（としない骨構造）に直接影響を確保するための人材育成、組織の明確な可視化、インパクチップが含まれています。
ラットは常に最も重要なのは必要なバイタルサインのコア温度と呼吸するための手順の間に観察されるべきである。低体温は、麻酔投与中及び直後に死亡の主要な原因である。直腸プローブおよび適切な加熱パッド付きのコア温度の監視はこの合併症を避けることができます。呼吸が不規則になったり、動物が息をしなくなった場合、手続きはすぐにベースラインに戻って呼吸するまで停止する必要があります。痛みや麻酔薬の投与量以上の過剰な痛みや、または不注意にも問題が呼吸になることがあります。ラットを注意深く後の手順を監視する必要があります。彼らのwエイトは、評価と治療のための獣医スタッフとの早期の協議が不可欠であるなど、正確に測定されるべきであり、ベースライン体重から> 20％の損失が食品や水の摂取、尿路感染症、皮膚の損傷、ポストSCIイレウスの調査を促すべきであるそのような状況である。前述したように、14日目で膀胱の制御を取り戻していないラットは、潜在的に致命的な尿路感染症を避けるために、抗生物質に戻って起動する必要があります。
脊髄損傷は、変位法や一定の力メソッドのいずれかによって誘導することができる。本稿で述べた5,12技術は力が脊髄組織内に固定された深さに配信される変位法である。コンピュータ制御されたインパクの使用は実験SCIの他の一般的な方法で達成可能ではない制御のレベルを可能にします。 NYUインパクトながらクリップ圧縮技術は、即時釈放と鈍い、打撲の力のために許可されていませんまたは挫傷の力を決定するために、重力に依存します。これらの技術は、再現したが、自動車事故、ヒトにおける急性SCIの最も一般的な原因の間に遭遇する条件のシミュレーションを許可しない。以前の研究では、損傷の重症が直接衝撃の速度よりも、衝撃の深さと相関することが示されている。したがって、このモデルは7力と変位の組み合わせも大きい範囲で重大度を変更するために日常的に電位を行うことが深刻なSCIを可能にする。
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Disclosures
財務情報の開示なし
資金調達の開示なし。
Acknowledgments
著者は、このモデルの開発における彼らの指導のために博士N. Banik博士とD.ミッチェルに感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computer controlled impactor | Leica or the Infinite Horizons (formerly OSU) impactor | ||
| Surgical instruments | |||
| Scissors | Fine Science Tools Inc | 14094-11 or 14060-09 | |
| Forceps | Fine Science Tools Inc | 11006-12 and 11027-12 or 11506-12 | |
| Hemostats | Fine Science Tools Inc | 13009-12 | |
| Retractors | Fine Science Tools Inc | 17011-10 | |
| Rongeurs | Fine Science Tools Inc | 16020-14 | |
| Needle driver | Fine Science Tools Inc | 12001-13 | |
| Stereotactic frame | Leica or RWD Life Science Co. or TSE systems | ||
| Buprinorphine | |||
| Baytril | Bayer | ||
| Ketamine | |||
References
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