השימוש בChemostats בביולוגיה מיקרוביאלית מערכות
Summary
שיעור צמיחת תאים הוא תהליך מוסדר וקובע עיקרי של פיזיולוגיה של תא. culturing הרציף באמצעות chemostats מאפשר שליטה חיצונית של שיעור צמיחת תאים על ידי הגבלה תזונתית להקל על הלימוד של רשתות מולקולריות השולטות צמיחת תאים וכיצד רשתות אלה להתפתח כדי לייעל את צמיחת תאים.
Abstract
תאים לווסת את קצב צמיחה שלהם בתגובה לאותות מהעולם החיצוני. כתא גדל, תהליכים תאיים שונים חייבים להיות מתואמים ביניהם סינתזת macromolecular, חילוף חומרים וסופו של דבר, מחויבת למחזור חלוקת תא. Chemostat, שיטה של ניסוי שליטה שיעור צמיחת תאים, מספקת אמצעי רב עוצמה של שיטתי לומד כיצד תהליכים תאיים משפיע שיעור צמיחה – הכוללים ביטוי גנים וחילוף חומרים – ורשתות רגולטורים ששולטות בקצב גדילת תאים. כאשר נשמר במשך מאות דורות chemostats יכול לשמש כדי לחקור אבולוציה אדפטיבית של חיידקים בתנאים סביבתיים המגבילים את צמיחת תאים. אנו מתארים את העיקרון של תרבויות chemostat, להדגים את פעולתם ולספק דוגמאות של היישומים השונים שלהם. לאחר תקופה של חוסר שימוש לאחר כניסתה שלהם באמצע המאה העשרים, ההתכנסות של מתודולוגיות הגנום בקנה מידה עם מחודשת בterest בויסות גדילת תאים ואת הבסיס המולקולרי של אבולוציה אדפטיבית הוא מגרה רנסנס בשימוש בchemostats במחקר ביולוגי.
Introduction
הצמיחה של תאים מווסתות על ידי רשתות מורכבות של האינטראקציה 1,2 גורמים גנטיים וסביבתיים. הרגולציה multifactorial של צמיחת תאים מחייבת גישה ברמת מערכת למחקר שלה. עם זאת, המחקר הקפדני של צמיחת תאים מוסדרת הוא קרא תיגר על ידי הקושי בניסוי שליטה על הקצב שבו תאים לגדול. יתר על כן, אפילו בניסויים הפשוטים תנאים תאיים הם לעתים קרובות דינמיים ומורכבים כמו תאים ברציפות לשנות את הסביבה שלהם כמו שהם מתרבים. פתרון לבעיות אלו מסופק על ידי chemostat: שיטה של culturing תאים המאפשרת שליטת ניסיוני של שיעורי צמיחת תאים בסביבות מוגדרות, בלתי משתנה ומבוקרות.
השיטה של תרבית רציפה באמצעות chemostat תוארה באופן עצמאי על ידי מונה 3 ונוביק & 4 סילארד ב1950. כמו נולד במקור, תאים גדלים בנפח קבוע של תקשורת שהוא קוןדילול tinually על ידי תוספת של מדיה חדשה וההסרה בו זמנית של אמצעי תקשורת ותאים ישנים (איור 1). משוואות דיפרנציאליות רגילות יחד (איור 2) מתארות את שיעור השינוי בתא צפיפות (x) ואת הריכוז של חומר מזין הגבלת צמיחה (ים) בכלי chemostat. חשוב מכך, מערכת זו של משוואות צופה בודד (שאינו אפס) יציב מצב יציב (איור 3) עם המשמעות יוצאת דופן, כי במצב יציב, קצב הגידול הספציפי של התאים (כלומר קבוע שיעור צמיחה מעריכית) שווה לשיעור שבתרבות בדילול מלא (ד '). על ידי שינוי שיעור דילול זה אפשרי להקים אוכלוסיות מצב יציב של תאים על שיעורי צמיחה שונים ובתנאים שונים של הגבלה תזונתית.
השליטה הניסיונית של שיעור צמיחה באמצעות chemostats הייתה קריטית להתפתחות של הבנה של אופן ששינויים בפיזיולוגיה של תאיםעם שיעורים של 5,6 צמיחה. עם זאת, עמוד התווך לשעבר זה של שיטות מיקרוביולוגיות הפך מעורפל יותר ויותר במהלך הפיצוץ במחקר בביולוגיה מולקולרית בשלהיי המאה העשרים. כיום, עניין מחודש בצמיחת שליטה בשני חיידקים ויצורים רב תאיים וכניסתו של שיטות הגנום בקנה מידה לניתוח ברמת מערכות חידש מוטיבציה לשימוש בchemostats. כאן, אנו מתארים שלושה יישומים שמנצלים את השליטה המדויקת של שיעורי צמיחת תא והסביבה החיצונית, כי הם ייחודי אפשריים באמצעות chemostats. ראשית, אנו מתארים את השימוש של chemostats לחקור כיצד השפע של אלפי ביומולקולות – כגון תמלילים ומטבוליטים – מוסדרים מתואם עם קצב צמיחה. שנית, אנו מתארים כיצד ניתן להשתמש chemostats לקבל אומדנים מדויקים של הבדלי צמיחה בשיעור שבין גנוטיפים שונים בסביבות מוגבלות תזונתיים באמצעות ניסויי תחרות. שלישית, אנו מתארים כיצד chemostats יכוללשמש כדי לחקור אבולוציה אדפטיבית של תאים גדל בסביבות תזונתיות ירודה קבועים. דוגמאות אלה ממחישים את הדרכים שבהן chemostats מאפשרות לחקירות ברמת מערכות של רגולציה צמיחת תאים, גן על ידי אינטראקציות סביבה והתפתחות אדפטיבית.
Protocol
Representative Results
Discussion
Chemostats לאפשר הטיפוח של חיידקים בתנאי מצב יציב בשליטת צמיחה. התאים גדלים ברציפות בקצב קבוע וכתוצאה מכך סביבה חיצונית משתנה. זאת בניגוד לשיטות התרבות אצווה שבסביבה החיצונית משתנית ללא הרף ובקצב צמיחת תאים נקבע על ידי האינטראקציה המורכבת של הסביבה וגנוטיפ. לפיכך, יתרון …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי להתחיל את כספים בצורה של אוניברסיטת ניו יורק. אנו מודים מאטרייה דאנהם ומאט בראואר, שפתח בתחילה את השימוש בbioreactors Sixfors כchemostats.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Infors-HT Sixfors Chemostat | Appropriate Technical Resources, Inc. | ||
| Glass Bottle 9.5 L | Fisher Scientific | 02-887-1 | For Media Vessel and Hosing |
| Pinchcock | Fisher Scientific | 05-867 | For Media Vessel and Hosing |
| Stopper, Size 12, Green Neoprene | Cole-Palmer | EW-62991-42 | For Media Vessel and Hosing |
| Straight Connector | Cole-Palmer | EW-30703-02 | For Media Vessel and Hosing |
| General purpose ties 4 in | Fisher Scientific | NC9557052 | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone Rubber | Small Parts | B000FMWTDE | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone, 3/8 in OD | Fisher Scientific | 02-587-1Q | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone, 7/32 in OD | Fisher Scientific | 02-587-1E | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Stainless Steel, 3/16 in OD | McMaster-Carr | 6100K164 | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Stainless Steel, 3/8 in OD | McMaster-Carr | 6100K161 | For Media Vessel and Hosing |
| Hook Connectors | Fisher Scientific | 14-66-18Q | For Media Vessel and Hosing |
| Ratchet Clamp | Cole-Palmer | EW-06403-11 | For Media Vessel and Hosing |
| Luer, Female | Cole-Palmer | EW-45512-34 | For Media Vessel and Hosing |
| Luer, Male | Cole-Palmer | EW-45513-04 | For Media Vessel and Hosing |
| Millipore Aervent MTGR05010 62 mm Filter, 0.2 μm | Fisher Scientific | MTGR05010 | For Media Vessel and Hosing |
| PTFE Acrodisc CR 13 mm filters, 0.2 μm | Fisher Scientific | NC9131037 | For Media Vessel and Hosing |
| Direct-Reading Flowtube for Air | Cole-Palmer | EW-32047-77 | For Nitrogen Gas Setup |
| Direct-Reading Flowtube for Nitrogen | Cole-Palmer | EW-32048-63 | For Nitrogen Gas Setup |
| Gas Proportioner Multitube Frames | Cole-Palmer | EW-03218-50 | For Nitrogen Gas Setup |
| Regulator, Two-Stage Analytical | Airgas | Y12-N145D580 | For Nitrogen Gas Setup |
| Hose Adaptor, Stainless Steel | Airgas | Y99-26450 | For Nitrogen Gas Setup |
| Hose Male Adaptor | Airgas | WES544 | For Nitrogen Gas Setup |
| Norprene Tubing | US Plastics | 57280 | For Nitrogen Gas Setup |
| Tripod Base | Cole-Palmer | EW-03218-58 | For Nitrogen Gas Setup |
| Valve Cartridges | Cole-Palmer | EW-03217-92 | For Nitrogen Gas Setup |
| Carboy 10 L | Fisher Scientific | 02-963-2A | For Media Preperation |
| Steritop Sterile Vacuum Bottle-Top Filters, 1,000 ml, PES membrane; for 45 mm neck size | Fisher Scientific | SCGP-T10-RE | For Media Preperation |
| Media Bottle 100 ml, 45 mm neck size | Fisher Scientific | FB-800-100 | For Media Preperation |
| calcium chloride·2H2O | Fisher Scientific | C79-500 | Media Reagents |
| sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | Media Reagents |
| magnesium sulfate·7H2O | Sigma Aldrich | 230391 | Media Reagents |
| potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | AC424205000 | Media Reagents |
| ammonium sulfate | Fisher Scientific | AC423400010 | Media Reagents |
| potassium chloride | Sigma Aldrich | P9541 | Media Reagents |
| boric acid | Sigma Aldrich | B6768 | Media Reagents |
| copper sulfate·5H2O | Sigma Aldrich | 209198 | Media Reagents |
| potassium iodide | Sigma Aldrich | 60400 | Media Reagents |
| ferric chloride·6H2O | Fisher Scientific | I88-100 | Media Reagents |
| manganese sulfate·H2O | Sigma Aldrich | 230391 | Media Reagents |
| sodium molybdate·2H2O | Sigma Aldrich | M7634 | Media Reagents |
| zinc sulfate·7H2O | Fisher Scientific | Z68-500 | Media Reagents |
| biotin | Fisher Scientific | BP232-1 | Media Reagents |
| calcium pantothenate | Fisher Scientific | AC24330-1000 | Media Reagents |
| folic acid | Sigma Aldrich | F7876 | Media Reagents |
| inositol (aka myo-inositol) | Fisher Scientific | AC12226-1000 | Media Reagents |
| niacin (aka nicotinic acid) | Sigma Aldrich | N4126 | Media Reagents |
| p-aminobenzoic acid | Fisher Scientific | AC14621-2500 | Media Reagents |
| pyridoxine HCl | Sigma Aldrich | P9755 | Media Reagents |
| riboflavin | Sigma Aldrich | R4500-25G | Media Reagents |
| thiamine HCl | Fisher Scientific | BP892-100 | Media Reagents |
| Leucine | Sigma Aldrich | L8000-100G | Media Reagents |
| Uracil | Sigma Aldrich | U0750 | Media Reagents |
| Dextrose | Fisher Scientific | DF0155-08-5 | Media Reagents |
References
- Ingraham, J. L., Maaloe, O., Neidhardt, F. C. . Growth of the Bacterial Cell. , (1983).
- Hall, M. N., Raff, M. C., Thomas, G. . Cell Growth: Control of Cell Size. , (2004).
- Monod, J. La technique de culture continue, theorie et applications. Ann. Inst. Pasteur. 79, 390-410 (1950).
- Novick, A., Szilard, L. Description of the chemostat. Science. 112, 715-716 (1950).
- Kjeldgaard, N. O., Maaloe, O., Schaechter, M. The transition between different physiological states during balanced growth of Salmonella typhimurium. J. Gen. Microbiol. 19, 607-616 (1958).
- Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. Control of macromolecular synthesis. , (1966).
- Saldanha, A. J., Brauer, M. J., Botstein, D. Nutritional Homeostasis in Batch and Steady-State. Culture of Yeast. Mol. Biol. Cell. 15, 4089-4104 (2004).
- Boer, V. M., Crutchfield, C. A., Bradley, P. H., Botstein, D., Rabinowitz, J. D. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Mol. Biol. Cell. 21, 198-211 (2010).
- Boer, V. M., de Winde, J. H., Pronk, J. T., Piper, M. D. The genome-wide transcriptional responses of Saccharomyces cerevisiae grown on glucose in aerobic chemostat cultures limited for carbon, nitrogen, phosphorus, or sulfur. J. Biol. Chem. 278, 3265-3274 (2003).
- Brauer, M. J., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Mol. Biol. Cell. 19, 352-367 (2008).
- Gresham, D., et al. Adaptation to diverse nitrogen-limited environments by deletion or extrachromosomal element formation of the GAP1 locus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 18551-18556 (2010).
- Regenberg, B., et al. Growth-rate regulated genes have profound impact on interpretation of transcriptome profiling in Saccharomyces cerevisiae. Genome Biol. 7, R107 (2006).
- Castrillo, J. I., et al. Growth control of the eukaryote cell: a systems biology study in yeast. J. Biol. 6, 4 (2007).
- Cipollina, C., et al. Revisiting the role of yeast Sfp1 in ribosome biogenesis and cell size control: a chemostat study. Microbiology. 154, 337-346 (2008).
- Gresham, D., et al. System-level analysis of genes and functions affecting survival during nutrient starvation in Saccharomyces cerevisiae. 유전학. 187, 299-317 (2011).
- Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant. PLoS Biol. 10, e1001325 (2012).
- Kao, K. C., Sherlock, G. Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae. Nat. Genet. 40, 1499-1504 (2008).
- Gresham, D., et al. The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoS Genet. 4, e1000303 (2008).
- Wenger, J. W., et al. Hunger Artists: Yeast Adapted to Carbon Limitation Show Trade-Offs under Carbon Sufficiency. PLoS Genet. 7, e1002202 (2011).
- Dunham, M. J., et al. Characteristic genome rearrangements in experimental evolution of Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16144-16149 (2002).
- Ronen, M., Botstein, D. Transcriptional response of steady-state yeast cultures to transient perturbations in carbon source. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 389-394 (2006).
- Kresnowati, M. T. A. P., et al. When transcriptome meets metabolome: fast cellular responses of yeast to sudden relief of glucose limitation. Mol. Sys. Biol. 2, 49 (2006).
- Tu, B. P., Kudlicki, A., Rowicka, M., McKnight, S. L. Logic of the yeast metabolic cycle: temporal compartmentalization of cellular processes. Science. 310, 1152-1158 (2005).
- Tzur, A., Kafri, R., LeBleu, V. S., Lahav, G., Kirschner, M. W. Cell Growth and Size Homeostasis in Proliferating Animal Cells. Science. 325, 167-171 (2009).
- Conlon, I., Raff, M. Size control in animal development. Cell. 96, 235-244 (1999).
- Conlon, I. J., Dunn, G. A., Mudge, A. W., Raff, M. C. Extracellular control of cell size. Nat. Cell Biol. 3, 918-921 (2001).
- Fussmann, G. F., Ellner, S. P., Shertzer, K. W., Hairston, N. G. Crossing the hopf bifurcation in a live predator-prey system. Science. 290, 1358-1360 (2000).
- Cohen, E. P., Eagle, H. A simplified chemostat for the growth of mammalian cells: characteristics of cell growth in continuous culture. J. Exp. Med. 113, 467-474 (1961).
