استخدام الكيموستات في الميكروبية بيولوجيا الأنظمة
Summary
معدل نمو الخلايا هو عملية تنظيم والمحددات الأساسية لعلم وظائف الأعضاء الخلية. زراعة المستمر باستخدام الكيموستات يمكن السيطرة خارجي من معدل نمو الخلايا بالتقادم المغذيات تسهيل دراسة الشبكات الجزيئية التي تتحكم في نمو الخلايا وكيف تتطور هذه الشبكات لتحسين نمو الخلايا.
Abstract
خلايا تنظيم معدل نموها في استجابة لإشارات من العالم الخارجي. مع نمو الخلية والعمليات الخلوية المختلفة يجب أن تكون منسقة بما في ذلك تجميع الجزيئات، والتمثيل الغذائي، وفي نهاية المطاف، والالتزام دورة انقسام الخلية. وناظم كيميائي، وهي طريقة للسيطرة على تجريبيا معدل نمو الخلايا، ويوفر وسيلة قوية لدراسة منهجية كيفية تأثير معدل نمو العمليات الخلوية – بما في ذلك التعبير الجيني والتمثيل الغذائي – والشبكات التنظيمية التي تتحكم في معدل نمو الخلايا. عندما يحتفظ به لمئات من الأجيال الكيموستات يمكن استخدامها لدراسة تطور التكيف من الميكروبات في الظروف البيئية التي تحد من نمو الخلايا. وصفنا مبدأ ناظم كيميائي الثقافات، وإظهار عملها وتقديم أمثلة من التطبيقات المختلفة. بعد فترة من الاهمال بعد بدء العمل بها في منتصف القرن العشرين، تلاقي المنهجيات الجينوم على نطاق ومع تجدد فيterest في تنظيم نمو الخلايا والأساس الجزيئي للتطور التكيف هو تحفيز نهضة في استخدام الكيموستات في الأبحاث البيولوجية.
Introduction
وينظم نمو الخلايا من خلال شبكات معقدة من التفاعل عوامل وراثية وبيئية 1،2. تنظيم سياقاتها من نمو الخلايا يتطلب نهجا على مستوى النظام لدراستها. ومع ذلك، يتم الطعن في دراسة دقيقة من نمو الخلايا ينظمها صعوبة السيطرة تجريبيا المعدل الذي تنمو الخلايا. علاوة على ذلك، حتى في أبسط التجارب الظروف خارج الخلية هي في كثير من الأحيان ديناميكية ومعقدة كخلايا تغيير بيئتهم بشكل مستمر لأنها تتكاثر. يتم توفير حل لهذه المشاكل من قبل ناظم كيميائي: وسيلة لزرع الخلايا التي يمكن السيطرة التجريبية من معدلات نمو الخلايا في بيئات محددة، ثابتة والسيطرة عليها.
طريقة زراعة المستمر باستخدام ناظم كيميائي وصفت بشكل مستقل من قبل مونود 3 و 4 نوفيك وزيلارد في عام 1950. كما تصور في الأصل، وتزرع الخلايا في حجم ثابت من وسائل الإعلام وهذا هو يخدعالمخفف tinually بإضافة وسائل الإعلام الجديدة وإزالة في وقت واحد من وسائل الإعلام القديمة والخلايا (الشكل 1). إلى جانب المعادلات التفاضلية العادية (الشكل 2) وصف معدل التغير في كثافة الخلية (س) وتركيز المغذيات منظم النمو (ق) في السفينة ناظم كيميائي. الأهم من ذلك، هذا النظام من المعادلات تتنبأ واحد (صفرية) مستقرة ثابتة للدولة (الشكل 3) مع ضمنا ملحوظا أنه في الحالة المستقرة، ومعدل نمو محدد من الخلايا (أي ثابت معدل النمو الأسي) يساوي معدل الذي يتم تخفيفه ثقافة (D). من خلال تغيير معدل التخفيف من الممكن لإقامة السكان المطرد للدولة من الخلايا في معدلات نمو مختلفة وتحت ظروف مختلفة من قيود المغذيات.
كانت السيطرة التجريبية من معدل النمو باستخدام الكيموستات حاسمة لتطوير فهم كيف يمكن للتغييرات فسيولوجية الخليةمع معدلات النمو 5،6. ومع ذلك، أصبح هذا دعامة السابق الأساليب الميكروبيولوجية غامضة بشكل متزايد خلال انفجار في البحوث البيولوجيا الجزيئية في أواخر القرن العشرين. اليوم، تجدد الاهتمام في السيطرة النمو في كل من الميكروبات والكائنات الحية متعددة الخلايا وظهور أساليب الجينوم على نطاق وللتحليل على مستوى النظم جددت الدافع لاستخدام الكيموستات. هنا، نحن تصف ثلاثة التطبيقات التي تستفيد من مراقبة دقيقة لمعدلات نمو الخلية والبيئة الخارجية التي من الممكن فريد باستخدام الكيموستات. أولا، نحن تصف استخدام الكيموستات إلى التحقيق في كيفية وفرة الآلاف من الجزيئات الحيوية – وينظم coordinately مع معدل النمو – مثل النصوص ونواتج الأيض. الثاني، نحن تصف كيف يمكن استخدام الكيموستات للحصول على تقديرات دقيقة للاختلافات معدل النمو بين الأنماط الجينية المختلفة في بيئات محدودة المغذيات باستخدام التجارب المنافسة. الثالث، ونحن تصف كيفية الكيموستات يمكنأن تستخدم لدراسة التطور على التكيف من خلايا تنمو في بيئات فقيرة بالمغذيات ثابتة. هذه الأمثلة أمثلة الطرق التي الكيموستات يتم تمكين التحقيقات على مستوى نظم تنظيم نمو الخلايا، الجين عن طريق تفاعلات البيئة والتطور على التكيف.
Protocol
Representative Results
Discussion
الكيموستات تمكين زراعة الميكروبات في ظروف الحالة المستقرة التي تسيطر عليها النمو. الخلايا تنمو بشكل مستمر بمعدل ثابت مما يؤدي إلى بيئة خارجية ثابتة. هذا هو على النقيض من الأساليب ثقافة دفعة في البيئة الخارجية التي تتغير باستمرار ويتم تحديد معدل نمو الخلايا من خلال ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل عن طريق بدء الأموال من جامعة نيويورك. نشكر مايتريا دنهام ومات براور الذي طور في البداية استخدام المفاعلات الحيوية Sixfors كما الكيموستات.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Infors-HT Sixfors Chemostat | Appropriate Technical Resources, Inc. | ||
| Glass Bottle 9.5 L | Fisher Scientific | 02-887-1 | For Media Vessel and Hosing |
| Pinchcock | Fisher Scientific | 05-867 | For Media Vessel and Hosing |
| Stopper, Size 12, Green Neoprene | Cole-Palmer | EW-62991-42 | For Media Vessel and Hosing |
| Straight Connector | Cole-Palmer | EW-30703-02 | For Media Vessel and Hosing |
| General purpose ties 4 in | Fisher Scientific | NC9557052 | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone Rubber | Small Parts | B000FMWTDE | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone, 3/8 in OD | Fisher Scientific | 02-587-1Q | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone, 7/32 in OD | Fisher Scientific | 02-587-1E | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Stainless Steel, 3/16 in OD | McMaster-Carr | 6100K164 | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Stainless Steel, 3/8 in OD | McMaster-Carr | 6100K161 | For Media Vessel and Hosing |
| Hook Connectors | Fisher Scientific | 14-66-18Q | For Media Vessel and Hosing |
| Ratchet Clamp | Cole-Palmer | EW-06403-11 | For Media Vessel and Hosing |
| Luer, Female | Cole-Palmer | EW-45512-34 | For Media Vessel and Hosing |
| Luer, Male | Cole-Palmer | EW-45513-04 | For Media Vessel and Hosing |
| Millipore Aervent MTGR05010 62 mm Filter, 0.2 μm | Fisher Scientific | MTGR05010 | For Media Vessel and Hosing |
| PTFE Acrodisc CR 13 mm filters, 0.2 μm | Fisher Scientific | NC9131037 | For Media Vessel and Hosing |
| Direct-Reading Flowtube for Air | Cole-Palmer | EW-32047-77 | For Nitrogen Gas Setup |
| Direct-Reading Flowtube for Nitrogen | Cole-Palmer | EW-32048-63 | For Nitrogen Gas Setup |
| Gas Proportioner Multitube Frames | Cole-Palmer | EW-03218-50 | For Nitrogen Gas Setup |
| Regulator, Two-Stage Analytical | Airgas | Y12-N145D580 | For Nitrogen Gas Setup |
| Hose Adaptor, Stainless Steel | Airgas | Y99-26450 | For Nitrogen Gas Setup |
| Hose Male Adaptor | Airgas | WES544 | For Nitrogen Gas Setup |
| Norprene Tubing | US Plastics | 57280 | For Nitrogen Gas Setup |
| Tripod Base | Cole-Palmer | EW-03218-58 | For Nitrogen Gas Setup |
| Valve Cartridges | Cole-Palmer | EW-03217-92 | For Nitrogen Gas Setup |
| Carboy 10 L | Fisher Scientific | 02-963-2A | For Media Preperation |
| Steritop Sterile Vacuum Bottle-Top Filters, 1,000 ml, PES membrane; for 45 mm neck size | Fisher Scientific | SCGP-T10-RE | For Media Preperation |
| Media Bottle 100 ml, 45 mm neck size | Fisher Scientific | FB-800-100 | For Media Preperation |
| calcium chloride·2H2O | Fisher Scientific | C79-500 | Media Reagents |
| sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | Media Reagents |
| magnesium sulfate·7H2O | Sigma Aldrich | 230391 | Media Reagents |
| potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | AC424205000 | Media Reagents |
| ammonium sulfate | Fisher Scientific | AC423400010 | Media Reagents |
| potassium chloride | Sigma Aldrich | P9541 | Media Reagents |
| boric acid | Sigma Aldrich | B6768 | Media Reagents |
| copper sulfate·5H2O | Sigma Aldrich | 209198 | Media Reagents |
| potassium iodide | Sigma Aldrich | 60400 | Media Reagents |
| ferric chloride·6H2O | Fisher Scientific | I88-100 | Media Reagents |
| manganese sulfate·H2O | Sigma Aldrich | 230391 | Media Reagents |
| sodium molybdate·2H2O | Sigma Aldrich | M7634 | Media Reagents |
| zinc sulfate·7H2O | Fisher Scientific | Z68-500 | Media Reagents |
| biotin | Fisher Scientific | BP232-1 | Media Reagents |
| calcium pantothenate | Fisher Scientific | AC24330-1000 | Media Reagents |
| folic acid | Sigma Aldrich | F7876 | Media Reagents |
| inositol (aka myo-inositol) | Fisher Scientific | AC12226-1000 | Media Reagents |
| niacin (aka nicotinic acid) | Sigma Aldrich | N4126 | Media Reagents |
| p-aminobenzoic acid | Fisher Scientific | AC14621-2500 | Media Reagents |
| pyridoxine HCl | Sigma Aldrich | P9755 | Media Reagents |
| riboflavin | Sigma Aldrich | R4500-25G | Media Reagents |
| thiamine HCl | Fisher Scientific | BP892-100 | Media Reagents |
| Leucine | Sigma Aldrich | L8000-100G | Media Reagents |
| Uracil | Sigma Aldrich | U0750 | Media Reagents |
| Dextrose | Fisher Scientific | DF0155-08-5 | Media Reagents |
References
- Ingraham, J. L., Maaloe, O., Neidhardt, F. C. . Growth of the Bacterial Cell. , (1983).
- Hall, M. N., Raff, M. C., Thomas, G. . Cell Growth: Control of Cell Size. , (2004).
- Monod, J. La technique de culture continue, theorie et applications. Ann. Inst. Pasteur. 79, 390-410 (1950).
- Novick, A., Szilard, L. Description of the chemostat. Science. 112, 715-716 (1950).
- Kjeldgaard, N. O., Maaloe, O., Schaechter, M. The transition between different physiological states during balanced growth of Salmonella typhimurium. J. Gen. Microbiol. 19, 607-616 (1958).
- Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. Control of macromolecular synthesis. , (1966).
- Saldanha, A. J., Brauer, M. J., Botstein, D. Nutritional Homeostasis in Batch and Steady-State. Culture of Yeast. Mol. Biol. Cell. 15, 4089-4104 (2004).
- Boer, V. M., Crutchfield, C. A., Bradley, P. H., Botstein, D., Rabinowitz, J. D. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Mol. Biol. Cell. 21, 198-211 (2010).
- Boer, V. M., de Winde, J. H., Pronk, J. T., Piper, M. D. The genome-wide transcriptional responses of Saccharomyces cerevisiae grown on glucose in aerobic chemostat cultures limited for carbon, nitrogen, phosphorus, or sulfur. J. Biol. Chem. 278, 3265-3274 (2003).
- Brauer, M. J., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Mol. Biol. Cell. 19, 352-367 (2008).
- Gresham, D., et al. Adaptation to diverse nitrogen-limited environments by deletion or extrachromosomal element formation of the GAP1 locus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 18551-18556 (2010).
- Regenberg, B., et al. Growth-rate regulated genes have profound impact on interpretation of transcriptome profiling in Saccharomyces cerevisiae. Genome Biol. 7, R107 (2006).
- Castrillo, J. I., et al. Growth control of the eukaryote cell: a systems biology study in yeast. J. Biol. 6, 4 (2007).
- Cipollina, C., et al. Revisiting the role of yeast Sfp1 in ribosome biogenesis and cell size control: a chemostat study. Microbiology. 154, 337-346 (2008).
- Gresham, D., et al. System-level analysis of genes and functions affecting survival during nutrient starvation in Saccharomyces cerevisiae. 유전학. 187, 299-317 (2011).
- Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant. PLoS Biol. 10, e1001325 (2012).
- Kao, K. C., Sherlock, G. Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae. Nat. Genet. 40, 1499-1504 (2008).
- Gresham, D., et al. The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoS Genet. 4, e1000303 (2008).
- Wenger, J. W., et al. Hunger Artists: Yeast Adapted to Carbon Limitation Show Trade-Offs under Carbon Sufficiency. PLoS Genet. 7, e1002202 (2011).
- Dunham, M. J., et al. Characteristic genome rearrangements in experimental evolution of Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16144-16149 (2002).
- Ronen, M., Botstein, D. Transcriptional response of steady-state yeast cultures to transient perturbations in carbon source. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 389-394 (2006).
- Kresnowati, M. T. A. P., et al. When transcriptome meets metabolome: fast cellular responses of yeast to sudden relief of glucose limitation. Mol. Sys. Biol. 2, 49 (2006).
- Tu, B. P., Kudlicki, A., Rowicka, M., McKnight, S. L. Logic of the yeast metabolic cycle: temporal compartmentalization of cellular processes. Science. 310, 1152-1158 (2005).
- Tzur, A., Kafri, R., LeBleu, V. S., Lahav, G., Kirschner, M. W. Cell Growth and Size Homeostasis in Proliferating Animal Cells. Science. 325, 167-171 (2009).
- Conlon, I., Raff, M. Size control in animal development. Cell. 96, 235-244 (1999).
- Conlon, I. J., Dunn, G. A., Mudge, A. W., Raff, M. C. Extracellular control of cell size. Nat. Cell Biol. 3, 918-921 (2001).
- Fussmann, G. F., Ellner, S. P., Shertzer, K. W., Hairston, N. G. Crossing the hopf bifurcation in a live predator-prey system. Science. 290, 1358-1360 (2000).
- Cohen, E. P., Eagle, H. A simplified chemostat for the growth of mammalian cells: characteristics of cell growth in continuous culture. J. Exp. Med. 113, 467-474 (1961).
