Использование Хемостаты в Микробная системной биологии
Summary
Темпы роста сотового является регулируемым процессом и основным фактором, определяющим физиологии клетки. Непрерывное культивирование с использованием Хемостаты позволяет внешнюю контроль скорости роста клеток на ограничение питательных веществ облегчая изучение молекулярных сетей, которые контролируют рост клеток и как эти сети развиваются оптимизировать рост клеток.
Abstract
Клетки регулировать их скорость роста в ответ на сигналы из внешнего мира. Как клетка растет, различные клеточные процессы должны быть скоординированы в том числе синтеза макромолекул, обмена веществ и в конечном итоге, приверженность цикла клеточного деления. Хемостат, способ управления экспериментально скорость роста клеток, обеспечивает мощное средство систематически изучает, как влияет на скорость роста клеточных процессов – в том числе генной экспрессии и метаболизм – и регуляторных сетей, которые контролируют скорость роста клеток. Когда сохраняется в течение сотен поколений Хемостаты может быть использован для изучения адаптивной эволюции микробов в условиях окружающей среды, которые ограничивают рост клеток. Опишем принцип хемостата культур, продемонстрировать свою работу и привести примеры их различных приложений. После периода употребления после их введения в середине двадцатого века, сходимость геном масштаба методологий с возобновлено втерес в регуляции роста клеток и молекулярных основ адаптивной эволюции стимулирует возрождение в использовании Хемостаты в биологических исследований.
Introduction
Рост клеток регулируется сложных сетей взаимодействующих генетических и экологических факторов 1,2. Многофакторное регулирование роста клеток вызывает необходимость системного уровня подхода к его изучению. Тем не менее, строгое изучение регулируемого роста клеток встает трудность экспериментально контролировать скорость, с которой клетки растут. Более того, даже в простейших экспериментов внеклеточных условия часто динамичный и сложный, как клетки непрерывно изменять свое окружение, как они размножаются. Решение этих проблем обеспечивается хемостате: метод культивирования клеток, что позволяет экспериментально контроль темпов роста клеток в определенных, инвариантных и контролируемых условиях.
Метод непрерывного культивирования с использованием хемостата была независимо описывается Моно 3 и Новик & Сцилардом 4 в 1950 году. Как первоначально задумано, клетки выращивают в фиксированном объеме массовой информации, что является конtinually разбавляют добавлением новых медиа и одновременным удалением старых СМИ и клеток (рис. 1). Связанные обыкновенные дифференциальные уравнения (рис. 2) описывают скорость изменения плотности клеток (х) и концентрации роста ограничения питательных веществ (ы) в хемостатной судна. Важно отметить, что эта система уравнений предсказывает один (ненулевое) стабильное стационарное (рис. 3) с замечательной подразумевается, что в стационарном состоянии, удельная скорость роста клеток (то есть постоянных экспоненциальный рост) равна скорости при которой культура разбавляют (D). Изменяя степень разбавления можно установить стационарные популяции клеток с различной скоростью роста и при различных условиях ограничение питательных веществ.
Экспериментальная контроль скорости роста, используя Хемостаты имеет решающее значение для развития понимания того, как изменения физиологии клеткис темпами 5,6 роста. Тем не менее, этот бывший оплотом микробиологических методов становится все более неясным во время взрыва в молекулярной биологии исследований во время конца ХХ века. Сегодня, возрождение интереса к контролю роста в обоих микробов и многоклеточных организмов и появлением методов геном масштаба для анализа системы уровня возобновил мотивацию для использования Хемостаты. Здесь мы описываем три приложения, которые капитализировать на точный контроль темпов роста клеток и внешней средой, которые однозначно можно с помощью Хемостаты. Во-первых, мы описываем использование Хемостаты расследовать, как обилие тысяч биомолекул – например, стенограммы и метаболитов – согласованно регулируются с темпом роста. Во-вторых, мы опишем, как Хемостаты может быть использована для получения точных оценок различий роста ставок между разными генотипами в питательными веществами ограничиваются средами с помощью конкуренции эксперименты. В-третьих, мы опишем, как Хемостаты можетбыть использованы для изучения адаптивной эволюции клеток, растущих в постоянных бедных питательными веществами средах. Эти примеры иллюстрируют, каким образом Хемостаты включаете системы на уровне исследования регуляции роста клеток, геном по окружающей средой и адаптивной эволюции.
Protocol
Representative Results
Discussion
Хемостаты включить культивирование микробов в рост контролируемых условиях стационарных. Клетки растут непрерывно с постоянной скоростью, в результате чего инвариантной внешней среды. Это в отличие от способов периодической культуре, в которой внешняя среда постоянно меняется, а ск?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана запуска средства университета Нью-Йорка. Мы благодарим Майтрейя Данэм и Мэтт Брауэра, которые изначально разработанный использование Sixfors биореакторов как Хемостаты.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Infors-HT Sixfors Chemostat | Appropriate Technical Resources, Inc. | ||
| Glass Bottle 9.5 L | Fisher Scientific | 02-887-1 | For Media Vessel and Hosing |
| Pinchcock | Fisher Scientific | 05-867 | For Media Vessel and Hosing |
| Stopper, Size 12, Green Neoprene | Cole-Palmer | EW-62991-42 | For Media Vessel and Hosing |
| Straight Connector | Cole-Palmer | EW-30703-02 | For Media Vessel and Hosing |
| General purpose ties 4 in | Fisher Scientific | NC9557052 | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone Rubber | Small Parts | B000FMWTDE | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone, 3/8 in OD | Fisher Scientific | 02-587-1Q | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone, 7/32 in OD | Fisher Scientific | 02-587-1E | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Stainless Steel, 3/16 in OD | McMaster-Carr | 6100K164 | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Stainless Steel, 3/8 in OD | McMaster-Carr | 6100K161 | For Media Vessel and Hosing |
| Hook Connectors | Fisher Scientific | 14-66-18Q | For Media Vessel and Hosing |
| Ratchet Clamp | Cole-Palmer | EW-06403-11 | For Media Vessel and Hosing |
| Luer, Female | Cole-Palmer | EW-45512-34 | For Media Vessel and Hosing |
| Luer, Male | Cole-Palmer | EW-45513-04 | For Media Vessel and Hosing |
| Millipore Aervent MTGR05010 62 mm Filter, 0.2 μm | Fisher Scientific | MTGR05010 | For Media Vessel and Hosing |
| PTFE Acrodisc CR 13 mm filters, 0.2 μm | Fisher Scientific | NC9131037 | For Media Vessel and Hosing |
| Direct-Reading Flowtube for Air | Cole-Palmer | EW-32047-77 | For Nitrogen Gas Setup |
| Direct-Reading Flowtube for Nitrogen | Cole-Palmer | EW-32048-63 | For Nitrogen Gas Setup |
| Gas Proportioner Multitube Frames | Cole-Palmer | EW-03218-50 | For Nitrogen Gas Setup |
| Regulator, Two-Stage Analytical | Airgas | Y12-N145D580 | For Nitrogen Gas Setup |
| Hose Adaptor, Stainless Steel | Airgas | Y99-26450 | For Nitrogen Gas Setup |
| Hose Male Adaptor | Airgas | WES544 | For Nitrogen Gas Setup |
| Norprene Tubing | US Plastics | 57280 | For Nitrogen Gas Setup |
| Tripod Base | Cole-Palmer | EW-03218-58 | For Nitrogen Gas Setup |
| Valve Cartridges | Cole-Palmer | EW-03217-92 | For Nitrogen Gas Setup |
| Carboy 10 L | Fisher Scientific | 02-963-2A | For Media Preperation |
| Steritop Sterile Vacuum Bottle-Top Filters, 1,000 ml, PES membrane; for 45 mm neck size | Fisher Scientific | SCGP-T10-RE | For Media Preperation |
| Media Bottle 100 ml, 45 mm neck size | Fisher Scientific | FB-800-100 | For Media Preperation |
| calcium chloride·2H2O | Fisher Scientific | C79-500 | Media Reagents |
| sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | Media Reagents |
| magnesium sulfate·7H2O | Sigma Aldrich | 230391 | Media Reagents |
| potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | AC424205000 | Media Reagents |
| ammonium sulfate | Fisher Scientific | AC423400010 | Media Reagents |
| potassium chloride | Sigma Aldrich | P9541 | Media Reagents |
| boric acid | Sigma Aldrich | B6768 | Media Reagents |
| copper sulfate·5H2O | Sigma Aldrich | 209198 | Media Reagents |
| potassium iodide | Sigma Aldrich | 60400 | Media Reagents |
| ferric chloride·6H2O | Fisher Scientific | I88-100 | Media Reagents |
| manganese sulfate·H2O | Sigma Aldrich | 230391 | Media Reagents |
| sodium molybdate·2H2O | Sigma Aldrich | M7634 | Media Reagents |
| zinc sulfate·7H2O | Fisher Scientific | Z68-500 | Media Reagents |
| biotin | Fisher Scientific | BP232-1 | Media Reagents |
| calcium pantothenate | Fisher Scientific | AC24330-1000 | Media Reagents |
| folic acid | Sigma Aldrich | F7876 | Media Reagents |
| inositol (aka myo-inositol) | Fisher Scientific | AC12226-1000 | Media Reagents |
| niacin (aka nicotinic acid) | Sigma Aldrich | N4126 | Media Reagents |
| p-aminobenzoic acid | Fisher Scientific | AC14621-2500 | Media Reagents |
| pyridoxine HCl | Sigma Aldrich | P9755 | Media Reagents |
| riboflavin | Sigma Aldrich | R4500-25G | Media Reagents |
| thiamine HCl | Fisher Scientific | BP892-100 | Media Reagents |
| Leucine | Sigma Aldrich | L8000-100G | Media Reagents |
| Uracil | Sigma Aldrich | U0750 | Media Reagents |
| Dextrose | Fisher Scientific | DF0155-08-5 | Media Reagents |
References
- Ingraham, J. L., Maaloe, O., Neidhardt, F. C. . Growth of the Bacterial Cell. , (1983).
- Hall, M. N., Raff, M. C., Thomas, G. . Cell Growth: Control of Cell Size. , (2004).
- Monod, J. La technique de culture continue, theorie et applications. Ann. Inst. Pasteur. 79, 390-410 (1950).
- Novick, A., Szilard, L. Description of the chemostat. Science. 112, 715-716 (1950).
- Kjeldgaard, N. O., Maaloe, O., Schaechter, M. The transition between different physiological states during balanced growth of Salmonella typhimurium. J. Gen. Microbiol. 19, 607-616 (1958).
- Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. Control of macromolecular synthesis. , (1966).
- Saldanha, A. J., Brauer, M. J., Botstein, D. Nutritional Homeostasis in Batch and Steady-State. Culture of Yeast. Mol. Biol. Cell. 15, 4089-4104 (2004).
- Boer, V. M., Crutchfield, C. A., Bradley, P. H., Botstein, D., Rabinowitz, J. D. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Mol. Biol. Cell. 21, 198-211 (2010).
- Boer, V. M., de Winde, J. H., Pronk, J. T., Piper, M. D. The genome-wide transcriptional responses of Saccharomyces cerevisiae grown on glucose in aerobic chemostat cultures limited for carbon, nitrogen, phosphorus, or sulfur. J. Biol. Chem. 278, 3265-3274 (2003).
- Brauer, M. J., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Mol. Biol. Cell. 19, 352-367 (2008).
- Gresham, D., et al. Adaptation to diverse nitrogen-limited environments by deletion or extrachromosomal element formation of the GAP1 locus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 18551-18556 (2010).
- Regenberg, B., et al. Growth-rate regulated genes have profound impact on interpretation of transcriptome profiling in Saccharomyces cerevisiae. Genome Biol. 7, R107 (2006).
- Castrillo, J. I., et al. Growth control of the eukaryote cell: a systems biology study in yeast. J. Biol. 6, 4 (2007).
- Cipollina, C., et al. Revisiting the role of yeast Sfp1 in ribosome biogenesis and cell size control: a chemostat study. Microbiology. 154, 337-346 (2008).
- Gresham, D., et al. System-level analysis of genes and functions affecting survival during nutrient starvation in Saccharomyces cerevisiae. 유전학. 187, 299-317 (2011).
- Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant. PLoS Biol. 10, e1001325 (2012).
- Kao, K. C., Sherlock, G. Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae. Nat. Genet. 40, 1499-1504 (2008).
- Gresham, D., et al. The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoS Genet. 4, e1000303 (2008).
- Wenger, J. W., et al. Hunger Artists: Yeast Adapted to Carbon Limitation Show Trade-Offs under Carbon Sufficiency. PLoS Genet. 7, e1002202 (2011).
- Dunham, M. J., et al. Characteristic genome rearrangements in experimental evolution of Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16144-16149 (2002).
- Ronen, M., Botstein, D. Transcriptional response of steady-state yeast cultures to transient perturbations in carbon source. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 389-394 (2006).
- Kresnowati, M. T. A. P., et al. When transcriptome meets metabolome: fast cellular responses of yeast to sudden relief of glucose limitation. Mol. Sys. Biol. 2, 49 (2006).
- Tu, B. P., Kudlicki, A., Rowicka, M., McKnight, S. L. Logic of the yeast metabolic cycle: temporal compartmentalization of cellular processes. Science. 310, 1152-1158 (2005).
- Tzur, A., Kafri, R., LeBleu, V. S., Lahav, G., Kirschner, M. W. Cell Growth and Size Homeostasis in Proliferating Animal Cells. Science. 325, 167-171 (2009).
- Conlon, I., Raff, M. Size control in animal development. Cell. 96, 235-244 (1999).
- Conlon, I. J., Dunn, G. A., Mudge, A. W., Raff, M. C. Extracellular control of cell size. Nat. Cell Biol. 3, 918-921 (2001).
- Fussmann, G. F., Ellner, S. P., Shertzer, K. W., Hairston, N. G. Crossing the hopf bifurcation in a live predator-prey system. Science. 290, 1358-1360 (2000).
- Cohen, E. P., Eagle, H. A simplified chemostat for the growth of mammalian cells: characteristics of cell growth in continuous culture. J. Exp. Med. 113, 467-474 (1961).
