L'utilisation de chémostats dans microbienne biologie des systèmes
Summary
taux de croissance cellulaire est un processus réglementé et un facteur déterminant de la physiologie cellulaire. Culture en continu en utilisant chémostats permet un contrôle extrinsèque du taux de croissance des cellules par limitation des nutriments faciliter l'étude des réseaux moléculaires qui contrôlent la croissance cellulaire et la façon dont ces réseaux évoluent pour optimiser la croissance des cellules.
Abstract
Les cellules régulent leur taux de croissance en réponse à des signaux provenant du monde extérieur. Comme la cellule se développe, divers processus cellulaires doivent être coordonnés y compris la synthèse macromoléculaire, le métabolisme et, finalement, de l'engagement avec le cycle de la division cellulaire. Le chemostat, une méthode de contrôle expérimentalement le taux de croissance de la cellule, fournit un puissant moyen d'étudier systématiquement la façon dont les impacts des taux de croissance les processus cellulaires – y compris l'expression des gènes et le métabolisme – et les réseaux de régulation qui contrôlent le taux de croissance des cellules. Lorsque maintenue pendant des centaines de générations chémostats peut être utilisé pour étudier l'évolution adaptative des microbes dans des conditions environnementales qui limitent la croissance des cellules. Nous décrivons le principe des cultures chémostat, démontrer leur fonctionnement et de fournir des exemples de leurs diverses applications. Après une période de désuétude après leur introduction dans le milieu du XXe siècle, la convergence des méthodologies échelle du génome d'un renouvellement enintérêt dans la régulation de la croissance cellulaire et la base moléculaire de l'évolution adaptative est de stimuler une renaissance de l'utilisation des chémostats dans la recherche biologique.
Introduction
La croissance des cellules est régulée par des réseaux complexes d'interaction des facteurs génétiques et environnementaux 1,2. Le règlement multifactorielle de la croissance cellulaire nécessite une approche au niveau du système à son étude. Cependant, l'étude rigoureuse de la croissance cellulaire régulée est contestée par la difficulté de contrôler expérimentalement la vitesse à laquelle les cellules se développent. En outre, même dans les expériences les plus simples conditions extracellulaires sont souvent dynamique et complexe que les cellules modifient en permanence leur environnement comme ils prolifèrent. Une solution à ces problèmes est proposée par le chemostat: un procédé de culture de cellules qui permet un contrôle expérimental des taux de croissance de cellules dans des milieux définis, invariantes et contrôlées.
La méthode de culture en continu en utilisant un chemostat a été décrite de façon indépendante par Monod 3 et Novick et Szilard 4 en 1950. Conçu à l'origine, les cellules sont cultivées dans un volume fixe de médias qui est concontinuellement dilué par ajout de nouveaux médias et l'élimination simultanée des médias traditionnels et des cellules (Figure 1). Équations différentielles ordinaires couplées (figure 2) décrivent la vitesse de variation de la densité de cellules (x) et la concentration d'un nutriment (s) limitant la croissance dans le récipient chimiostatique. Surtout, ce système d'équations prédit un seul (non nul) stable à l'état d'équilibre (figure 3) avec l'implication remarquable à l'état d'équilibre, le taux de croissance spécifique des cellules (c'est à dire la constante de taux de croissance exponentiel) est égal au taux au cours de laquelle la culture est diluée (D). En faisant varier le taux de dilution, il est possible d'établir des populations à l'état stable de cellules à différents taux de croissance et dans différentes conditions de limitation en nutriments.
Le contrôle expérimental des taux de croissance à l'aide chémostats était essentielle pour le développement d'une compréhension de la façon dont les changements de la physiologie cellulaireavec des taux de croissance de 5,6. Cependant, cet ancien pilier de méthodes microbiologiques est devenu de plus en plus obscure lors de l'explosion dans la recherche en biologie moléculaire au cours de la fin du XXe siècle. Aujourd'hui, un regain d'intérêt dans le contrôle de la croissance dans les deux microbes et les organismes multicellulaires et l'avènement de méthodes échelle du génome pour l'analyse au niveau des systèmes a renouvelé motivation pour l'utilisation de chémostats. Ici, nous décrivons trois applications qui tirent sur le contrôle précis des taux de croissance de cellules et l'environnement extérieur qui sont uniquement possible en utilisant chémostats. Tout d'abord, nous décrivons l'utilisation de chémostats d'étudier comment l'abondance de milliers de biomolécules – tels que les transcriptions et des métabolites – sont réglementés de manière coordonnée avec les taux de croissance. Deuxièmement, nous décrivons comment chémostats peuvent être utilisées pour obtenir des estimations précises des écarts de taux de croissance entre les différents génotypes dans des environnements peu fertiles en utilisant des expériences de compétition. Troisièmement, nous décrivons comment peut chémostatsêtre utilisé pour étudier l'évolution adaptative des cellules en croissance dans des environnements pauvres en éléments nutritifs constants. Ces exemples illustrent la façon dont les chémostats activez enquêtes au niveau des systèmes de régulation de la croissance cellulaire, génique par des interactions de l'environnement et l'évolution adaptative.
Protocol
Representative Results
Discussion
Chémostats permettent la culture de microbes dans des conditions stables de croissance contrôlée. Les cellules se développent en continu à un débit constant résulte en un environnement externe invariant. Ceci est en contraste aux méthodes de culture du lot dans lequel l'environnement extérieur est en constante évolution et le taux de croissance des cellules est déterminé par l'interaction complexe de l'environnement et le génotype. Ainsi, un avantage majeur de la mise en culture des microbes dan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les fonds de démarrage forment la New York University. Nous remercions Maitreya Dunham et Matt Brauer qui a initialement développé l'utilisation de bioréacteurs Sixfors comme chémostats.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Infors-HT Sixfors Chemostat | Appropriate Technical Resources, Inc. | ||
| Glass Bottle 9.5 L | Fisher Scientific | 02-887-1 | For Media Vessel and Hosing |
| Pinchcock | Fisher Scientific | 05-867 | For Media Vessel and Hosing |
| Stopper, Size 12, Green Neoprene | Cole-Palmer | EW-62991-42 | For Media Vessel and Hosing |
| Straight Connector | Cole-Palmer | EW-30703-02 | For Media Vessel and Hosing |
| General purpose ties 4 in | Fisher Scientific | NC9557052 | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone Rubber | Small Parts | B000FMWTDE | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone, 3/8 in OD | Fisher Scientific | 02-587-1Q | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone, 7/32 in OD | Fisher Scientific | 02-587-1E | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Stainless Steel, 3/16 in OD | McMaster-Carr | 6100K164 | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Stainless Steel, 3/8 in OD | McMaster-Carr | 6100K161 | For Media Vessel and Hosing |
| Hook Connectors | Fisher Scientific | 14-66-18Q | For Media Vessel and Hosing |
| Ratchet Clamp | Cole-Palmer | EW-06403-11 | For Media Vessel and Hosing |
| Luer, Female | Cole-Palmer | EW-45512-34 | For Media Vessel and Hosing |
| Luer, Male | Cole-Palmer | EW-45513-04 | For Media Vessel and Hosing |
| Millipore Aervent MTGR05010 62 mm Filter, 0.2 μm | Fisher Scientific | MTGR05010 | For Media Vessel and Hosing |
| PTFE Acrodisc CR 13 mm filters, 0.2 μm | Fisher Scientific | NC9131037 | For Media Vessel and Hosing |
| Direct-Reading Flowtube for Air | Cole-Palmer | EW-32047-77 | For Nitrogen Gas Setup |
| Direct-Reading Flowtube for Nitrogen | Cole-Palmer | EW-32048-63 | For Nitrogen Gas Setup |
| Gas Proportioner Multitube Frames | Cole-Palmer | EW-03218-50 | For Nitrogen Gas Setup |
| Regulator, Two-Stage Analytical | Airgas | Y12-N145D580 | For Nitrogen Gas Setup |
| Hose Adaptor, Stainless Steel | Airgas | Y99-26450 | For Nitrogen Gas Setup |
| Hose Male Adaptor | Airgas | WES544 | For Nitrogen Gas Setup |
| Norprene Tubing | US Plastics | 57280 | For Nitrogen Gas Setup |
| Tripod Base | Cole-Palmer | EW-03218-58 | For Nitrogen Gas Setup |
| Valve Cartridges | Cole-Palmer | EW-03217-92 | For Nitrogen Gas Setup |
| Carboy 10 L | Fisher Scientific | 02-963-2A | For Media Preperation |
| Steritop Sterile Vacuum Bottle-Top Filters, 1,000 ml, PES membrane; for 45 mm neck size | Fisher Scientific | SCGP-T10-RE | For Media Preperation |
| Media Bottle 100 ml, 45 mm neck size | Fisher Scientific | FB-800-100 | For Media Preperation |
| calcium chloride·2H2O | Fisher Scientific | C79-500 | Media Reagents |
| sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | Media Reagents |
| magnesium sulfate·7H2O | Sigma Aldrich | 230391 | Media Reagents |
| potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | AC424205000 | Media Reagents |
| ammonium sulfate | Fisher Scientific | AC423400010 | Media Reagents |
| potassium chloride | Sigma Aldrich | P9541 | Media Reagents |
| boric acid | Sigma Aldrich | B6768 | Media Reagents |
| copper sulfate·5H2O | Sigma Aldrich | 209198 | Media Reagents |
| potassium iodide | Sigma Aldrich | 60400 | Media Reagents |
| ferric chloride·6H2O | Fisher Scientific | I88-100 | Media Reagents |
| manganese sulfate·H2O | Sigma Aldrich | 230391 | Media Reagents |
| sodium molybdate·2H2O | Sigma Aldrich | M7634 | Media Reagents |
| zinc sulfate·7H2O | Fisher Scientific | Z68-500 | Media Reagents |
| biotin | Fisher Scientific | BP232-1 | Media Reagents |
| calcium pantothenate | Fisher Scientific | AC24330-1000 | Media Reagents |
| folic acid | Sigma Aldrich | F7876 | Media Reagents |
| inositol (aka myo-inositol) | Fisher Scientific | AC12226-1000 | Media Reagents |
| niacin (aka nicotinic acid) | Sigma Aldrich | N4126 | Media Reagents |
| p-aminobenzoic acid | Fisher Scientific | AC14621-2500 | Media Reagents |
| pyridoxine HCl | Sigma Aldrich | P9755 | Media Reagents |
| riboflavin | Sigma Aldrich | R4500-25G | Media Reagents |
| thiamine HCl | Fisher Scientific | BP892-100 | Media Reagents |
| Leucine | Sigma Aldrich | L8000-100G | Media Reagents |
| Uracil | Sigma Aldrich | U0750 | Media Reagents |
| Dextrose | Fisher Scientific | DF0155-08-5 | Media Reagents |
References
- Ingraham, J. L., Maaloe, O., Neidhardt, F. C. . Growth of the Bacterial Cell. , (1983).
- Hall, M. N., Raff, M. C., Thomas, G. . Cell Growth: Control of Cell Size. , (2004).
- Monod, J. La technique de culture continue, theorie et applications. Ann. Inst. Pasteur. 79, 390-410 (1950).
- Novick, A., Szilard, L. Description of the chemostat. Science. 112, 715-716 (1950).
- Kjeldgaard, N. O., Maaloe, O., Schaechter, M. The transition between different physiological states during balanced growth of Salmonella typhimurium. J. Gen. Microbiol. 19, 607-616 (1958).
- Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. Control of macromolecular synthesis. , (1966).
- Saldanha, A. J., Brauer, M. J., Botstein, D. Nutritional Homeostasis in Batch and Steady-State. Culture of Yeast. Mol. Biol. Cell. 15, 4089-4104 (2004).
- Boer, V. M., Crutchfield, C. A., Bradley, P. H., Botstein, D., Rabinowitz, J. D. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Mol. Biol. Cell. 21, 198-211 (2010).
- Boer, V. M., de Winde, J. H., Pronk, J. T., Piper, M. D. The genome-wide transcriptional responses of Saccharomyces cerevisiae grown on glucose in aerobic chemostat cultures limited for carbon, nitrogen, phosphorus, or sulfur. J. Biol. Chem. 278, 3265-3274 (2003).
- Brauer, M. J., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Mol. Biol. Cell. 19, 352-367 (2008).
- Gresham, D., et al. Adaptation to diverse nitrogen-limited environments by deletion or extrachromosomal element formation of the GAP1 locus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 18551-18556 (2010).
- Regenberg, B., et al. Growth-rate regulated genes have profound impact on interpretation of transcriptome profiling in Saccharomyces cerevisiae. Genome Biol. 7, R107 (2006).
- Castrillo, J. I., et al. Growth control of the eukaryote cell: a systems biology study in yeast. J. Biol. 6, 4 (2007).
- Cipollina, C., et al. Revisiting the role of yeast Sfp1 in ribosome biogenesis and cell size control: a chemostat study. Microbiology. 154, 337-346 (2008).
- Gresham, D., et al. System-level analysis of genes and functions affecting survival during nutrient starvation in Saccharomyces cerevisiae. 유전학. 187, 299-317 (2011).
- Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant. PLoS Biol. 10, e1001325 (2012).
- Kao, K. C., Sherlock, G. Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae. Nat. Genet. 40, 1499-1504 (2008).
- Gresham, D., et al. The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoS Genet. 4, e1000303 (2008).
- Wenger, J. W., et al. Hunger Artists: Yeast Adapted to Carbon Limitation Show Trade-Offs under Carbon Sufficiency. PLoS Genet. 7, e1002202 (2011).
- Dunham, M. J., et al. Characteristic genome rearrangements in experimental evolution of Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16144-16149 (2002).
- Ronen, M., Botstein, D. Transcriptional response of steady-state yeast cultures to transient perturbations in carbon source. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 389-394 (2006).
- Kresnowati, M. T. A. P., et al. When transcriptome meets metabolome: fast cellular responses of yeast to sudden relief of glucose limitation. Mol. Sys. Biol. 2, 49 (2006).
- Tu, B. P., Kudlicki, A., Rowicka, M., McKnight, S. L. Logic of the yeast metabolic cycle: temporal compartmentalization of cellular processes. Science. 310, 1152-1158 (2005).
- Tzur, A., Kafri, R., LeBleu, V. S., Lahav, G., Kirschner, M. W. Cell Growth and Size Homeostasis in Proliferating Animal Cells. Science. 325, 167-171 (2009).
- Conlon, I., Raff, M. Size control in animal development. Cell. 96, 235-244 (1999).
- Conlon, I. J., Dunn, G. A., Mudge, A. W., Raff, M. C. Extracellular control of cell size. Nat. Cell Biol. 3, 918-921 (2001).
- Fussmann, G. F., Ellner, S. P., Shertzer, K. W., Hairston, N. G. Crossing the hopf bifurcation in a live predator-prey system. Science. 290, 1358-1360 (2000).
- Cohen, E. P., Eagle, H. A simplified chemostat for the growth of mammalian cells: characteristics of cell growth in continuous culture. J. Exp. Med. 113, 467-474 (1961).
