Celgroei tarief is een gereguleerd proces en een primaire determinant van cel fysiologie. Continue kweken met chemostaten maakt extrinsieke controle cellen groei met nutriënten limitatie de studie van moleculaire netwerken die celgroei en hoe deze netwerken ontwikkelen om optimale celgroei regelen vergemakkelijken.
Cellen reguleren hun groeitempo in reactie op signalen van de buitenwereld. Als de cel groeit, moeten diverse cellulaire processen worden gecoördineerd waaronder macromoleculaire synthese, metabolisme en uiteindelijk, betrokkenheid bij de celdeling cyclus. De chemostaat, een methode voor het regelen van experimenteel cel groei, biedt een krachtig middel systematisch bestuderen hoe groeipercentage gevolgen cellulaire processen – met inbegrip van genexpressie en stofwisseling – en de regulerende netwerken die het tempo van de celgroei. Wanneer gedurende honderden generaties chemostaten kan worden gebruikt om adaptieve evolutie van microben in milieuomstandigheden die de celgroei beperkt bestuderen. We beschrijven het principe van chemostaat culturen, tonen hun werking en geeft voorbeelden van de verschillende toepassingen. Na een periode van onbruik na hun introductie in het midden van de twintigste eeuw, de convergentie van genoom-schaal methodologieën met een vernieuwd inlangstelling in de regulatie van de celgroei en de moleculaire basis van adaptieve evolutie is het stimuleren van een renaissance in het gebruik van chemostaten in biologisch onderzoek.
De groei van cellen wordt geregeld door complexe netwerken van op elkaar inwerkende genetische en omgevingsfactoren 1,2. De multifactoriële regulatie van celgroei vereist een systeem-level benadering van haar studie. Echter, de strenge studie van gereguleerde celgroei uitgedaagd door de moeilijkheid experimenteel regelen van de snelheid waarmee cellen groeien. Bovendien, zelfs in de meest eenvoudige experimenten extracellulaire voorwaarden zijn vaak dynamisch en complex als de cellen voortdurend veranderen hun omgeving als ze zich kunnen vermenigvuldigen. Een oplossing voor deze problemen is door de chemostaat: een werkwijze voor het kweken van cellen die experimentele controle cel groei kunnen in bepaalde, invariante en gecontroleerde omgevingen.
Werkwijze continu kweken met een chemostaat werd onafhankelijk beschreven door Monod 3 en Novick & Szilard 4 in 1950. Zoals oorspronkelijk bedacht worden cellen gekweekt in een vast volume van media die continu verdund door toevoeging van nieuwe media en gelijktijdige verwijdering van oude media en cellen (figuur 1). Gekoppelde gewone differentiaalvergelijkingen (figuur 2) beschrijven de mate van verandering in cel dichtheid (x) en de concentratie van een groei-beperkende nutriënt (en) in de chemostaat vat. Belangrijk is dat deze stelsel van vergelijkingen voorspelt een enkele (nul) stabiele steady-state (figuur 3) met de opmerkelijke implicatie dat bij steady-state, de specifieke groeisnelheid van de cellen (dwz de exponentiële groei constant) is gelijk aan het tarief waarbij de kweek wordt verdund (D). Door het variëren van de verdunning is het mogelijk om steady-state populaties van cellen vast te stellen op verschillende groeipercentages en onder verschillende omstandigheden van nutriënten limitatie.
De experimentele controle groei middels chemostaten was cruciaal voor de ontwikkeling van een begrip van hoe celfysiologie veranderingenmet groeipercentages 5,6. Echter, deze voormalige steunpilaar van microbiologische methoden werd steeds obscure tijdens de explosie in het moleculair biologisch onderzoek in de late twintigste eeuw. Vandaag, hernieuwde belangstelling voor de groei controle in zowel microben en meercellige organismen en de komst van genoom-schaal voor systemen-niveau analyse is de motivatie voor het gebruik van chemostaten vernieuwd. We beschrijven hier drie toepassingen die inspelen op de precieze controle van de cel groeicijfers en de externe omgeving die uniek zijn mogelijk met behulp van chemostaten. Eerst beschrijven we het gebruik van chemostaten om te onderzoeken hoe de overvloed van duizenden biomoleculen – zoals transcripten en metabolieten – gecoördineerd worden gereguleerd met de groeisnelheid. Ten tweede, beschrijven we hoe chemostaten kan worden gebruikt om nauwkeurige ramingen van de groei-rate verschillen tussen verschillende genotypen in-nutriënten beperkt omgevingen met behulp van competitie-experimenten verkrijgen. Ten derde, we beschrijven hoe chemostaten kanworden gebruikt om adaptieve evolutie van cellen groeien in constante voedselarme omgevingen te bestuderen. Deze voorbeelden illustreren de manier waarop chemostaten worden waardoor systemen-niveau onderzoeken van de celgroei regelgeving, gen door milieu interacties en adaptieve evolutie.
Chemostaten staat de teelt van microben in-groei gecontroleerde steady-state condities. De cellen groeien continu met een constante snelheid waardoor een invariant externe omgeving. Dit in tegenstelling tot batch cultuur werkwijzen waarbij de externe omgeving verandert voortdurend en de groei wordt bepaald door een complexe interactie tussen omgeving en genotype. Aldus is een groot voordeel van het kweken van microben in chemostaten via batch cultuur is de mogelijkheid om experimenteel controle van de groei van cellen. …
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door het opstarten van fondsen van de New York University. Wij danken Maitreya Dunham en Matt Brauer, die het gebruik van Sixfors bioreactoren als chemostaten eerste instantie ontwikkeld.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Infors-HT Sixfors Chemostat | Appropriate Technical Resources, Inc. | ||
Glass Bottle 9.5 L | Fisher Scientific | 02-887-1 | For Media Vessel and Hosing |
Pinchcock | Fisher Scientific | 05-867 | For Media Vessel and Hosing |
Stopper, Size 12, Green Neoprene | Cole-Palmer | EW-62991-42 | For Media Vessel and Hosing |
Straight Connector | Cole-Palmer | EW-30703-02 | For Media Vessel and Hosing |
General purpose ties 4 in | Fisher Scientific | NC9557052 | For Media Vessel and Hosing |
Tubing, Silicone Rubber | Small Parts | B000FMWTDE | For Media Vessel and Hosing |
Tubing, Silicone, 3/8 in OD | Fisher Scientific | 02-587-1Q | For Media Vessel and Hosing |
Tubing, Silicone, 7/32 in OD | Fisher Scientific | 02-587-1E | For Media Vessel and Hosing |
Tubing, Stainless Steel, 3/16 in OD | McMaster-Carr | 6100K164 | For Media Vessel and Hosing |
Tubing, Stainless Steel, 3/8 in OD | McMaster-Carr | 6100K161 | For Media Vessel and Hosing |
Hook Connectors | Fisher Scientific | 14-66-18Q | For Media Vessel and Hosing |
Ratchet Clamp | Cole-Palmer | EW-06403-11 | For Media Vessel and Hosing |
Luer, Female | Cole-Palmer | EW-45512-34 | For Media Vessel and Hosing |
Luer, Male | Cole-Palmer | EW-45513-04 | For Media Vessel and Hosing |
Millipore Aervent MTGR05010 62 mm Filter, 0.2 μm | Fisher Scientific | MTGR05010 | For Media Vessel and Hosing |
PTFE Acrodisc CR 13 mm filters, 0.2 μm | Fisher Scientific | NC9131037 | For Media Vessel and Hosing |
Direct-Reading Flowtube for Air | Cole-Palmer | EW-32047-77 | For Nitrogen Gas Setup |
Direct-Reading Flowtube for Nitrogen | Cole-Palmer | EW-32048-63 | For Nitrogen Gas Setup |
Gas Proportioner Multitube Frames | Cole-Palmer | EW-03218-50 | For Nitrogen Gas Setup |
Regulator, Two-Stage Analytical | Airgas | Y12-N145D580 | For Nitrogen Gas Setup |
Hose Adaptor, Stainless Steel | Airgas | Y99-26450 | For Nitrogen Gas Setup |
Hose Male Adaptor | Airgas | WES544 | For Nitrogen Gas Setup |
Norprene Tubing | US Plastics | 57280 | For Nitrogen Gas Setup |
Tripod Base | Cole-Palmer | EW-03218-58 | For Nitrogen Gas Setup |
Valve Cartridges | Cole-Palmer | EW-03217-92 | For Nitrogen Gas Setup |
Carboy 10 L | Fisher Scientific | 02-963-2A | For Media Preperation |
Steritop Sterile Vacuum Bottle-Top Filters, 1,000 ml, PES membrane; for 45 mm neck size | Fisher Scientific | SCGP-T10-RE | For Media Preperation |
Media Bottle 100 ml, 45 mm neck size | Fisher Scientific | FB-800-100 | For Media Preperation |
calcium chloride·2H2O | Fisher Scientific | C79-500 | Media Reagents |
sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | Media Reagents |
magnesium sulfate·7H2O | Sigma Aldrich | 230391 | Media Reagents |
potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | AC424205000 | Media Reagents |
ammonium sulfate | Fisher Scientific | AC423400010 | Media Reagents |
potassium chloride | Sigma Aldrich | P9541 | Media Reagents |
boric acid | Sigma Aldrich | B6768 | Media Reagents |
copper sulfate·5H2O | Sigma Aldrich | 209198 | Media Reagents |
potassium iodide | Sigma Aldrich | 60400 | Media Reagents |
ferric chloride·6H2O | Fisher Scientific | I88-100 | Media Reagents |
manganese sulfate·H2O | Sigma Aldrich | 230391 | Media Reagents |
sodium molybdate·2H2O | Sigma Aldrich | M7634 | Media Reagents |
zinc sulfate·7H2O | Fisher Scientific | Z68-500 | Media Reagents |
biotin | Fisher Scientific | BP232-1 | Media Reagents |
calcium pantothenate | Fisher Scientific | AC24330-1000 | Media Reagents |
folic acid | Sigma Aldrich | F7876 | Media Reagents |
inositol (aka myo-inositol) | Fisher Scientific | AC12226-1000 | Media Reagents |
niacin (aka nicotinic acid) | Sigma Aldrich | N4126 | Media Reagents |
p-aminobenzoic acid | Fisher Scientific | AC14621-2500 | Media Reagents |
pyridoxine HCl | Sigma Aldrich | P9755 | Media Reagents |
riboflavin | Sigma Aldrich | R4500-25G | Media Reagents |
thiamine HCl | Fisher Scientific | BP892-100 | Media Reagents |
Leucine | Sigma Aldrich | L8000-100G | Media Reagents |
Uracil | Sigma Aldrich | U0750 | Media Reagents |
Dextrose | Fisher Scientific | DF0155-08-5 | Media Reagents |