Summary

تسجيل النشاط الكهربائي من الخلايا العصبية التي تم تحديدها في الدماغ سليمة من الأسماك المعدلة وراثيا

Published: April 30, 2013
doi:

Summary

في هذا الفيديو، ونحن سوف تظهر كيفية تسجيل النشاط الكهربائي من الخلايا العصبية التي تم تحديدها واحد في إعداد الدماغ كله، الذي يحافظ على الدارات العصبية المعقدة. نحن نستخدم الأسماك المعدلة وراثيا التي يتم تمييزها موجهة الغدد التناسلية لإفراز هرمون (هرمون GnRH) الخلايا العصبية وراثيا مع بروتين فلوري لتحديد الهوية في إعداد الدماغ سليمة.

Abstract

فهم الفيزيولوجيا الخلية من الدوائر العصبية التي تنظم السلوك المعقد هو تتعزز بشكل كبير عن طريق استخدام نظم نموذج التي يمكن من خلالها تنفيذ هذا العمل في إعداد الدماغ سليمة حيث لا يزال الدوائر العصبية في الجهاز العصبي المركزي سليمة. نحن نستخدم الأسماك المعدلة وراثيا التي يتم تمييزها موجهة الغدد التناسلية لإفراز هرمون (هرمون GnRH) الخلايا العصبية وراثيا مع بروتين الفلورية الخضراء لتحديد الهوية في الدماغ سليمة. وتحتوي الأسماك السكان متعددة من الخلايا العصبية هرمون GnRH، ووظائفها تعتمد على موقعها في المخ والجينات هرمون GnRH التي يبدونها 1. فقد ركزنا على مظاهرة لدينا GnRH3 الخلايا العصبية الموجودة في الأعصاب الطرفية (TN) المرتبطة بصيلات الشم باستخدام الدماغ سليمة من الأسماك المعدلة وراثيا الميداكا (الشكل 1B و C). تشير الدراسات إلى أن الخلايا العصبية الميداكا TN-GnRH3 هي neuromodulatory، بوصفها جهاز إرسال المعلومات من البيئة الخارجية إلى الجهاز العصبي المركزي؛ رمهلا لا تلعب دورا مباشرا في تنظيم وظائف الغدد التناسلية النخامية، كما يفعل المعروفة طائي GnRH1 الخلايا العصبية 2، 3. نمط منشط من إمكانات العمل العفوي إطلاق الخلايا العصبية TN-GnRH3 هو خاصية ذاتية 4-6، وتواتر الذي هو عن طريق التضمين الإشارات البصرية من conspecifics 2 وkisspeptin نيوروبيبتيدي 1 5. في هذا الفيديو، ونحن نستخدم خط مستقر من الميداكا المعدلة وراثيا في الخلايا العصبية التي TN-GnRH3 تعبر عن التحوير الذي يحتوي على منطقة المروج من Gnrh3 مرتبطة تعزيز البروتين الفلوري الأخضر 7 لتظهر لك كيفية التعرف على الخلايا العصبية ورصد نشاطهم الكهربائية في الدماغ كله إعداد 6.

Protocol

1. تشريح أدمغة من الكبار الميداكا تخدير الكبار من الذكور أو الإناث (الشكل 1A) من تخبط في 5 مل MS-222 (150 ملغ / لتر، ودرجة الحموضة 7.4)؛ الانتظار بضع دقائق بعد توقف الحركات الخياشيم قبل قطع الرقاب. وقد وافق جميع الإجراءا…

Representative Results

ويرد مثال على مجموعات ثنائية من GFP المسمى TN-GnRH3 الخلايا العصبية من الدماغ رفعه من الأسماك الميداكا في أرقام 1B و 1C. كل مجموعة تحتوي على حوالي 8-10 الخلايا العصبية هرمون GnRH. وسجلت أنشطة الخلايا العصبية عفوية من الهدف TN-GnRH3 في الوضع الحالي، المشبك (I = 0) مع م?…

Discussion

هرمون GnRH 3: GFP الأسماك المعدلة وراثيا تقدم نماذج فريدة لدراسة الآليات العصبية الكامنة وراء التكامل العصبية والتنظيم في السيطرة المركزية من السلوكيات التي هي على حد سواء يشارك بصورة مباشرة وغير مباشرة في الإنجاب 3، 8-10. واحدة من مزايا كبيرة من هذا النظام النم…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر الدكتور منغ تشين لين والسيدة دونغ يوان للمساعدة التقنية. وأيد هذا العمل من خلال منحة من المعاهد القومية للصحة HD053767 (من الباطن إلى NLW)، وصناديق من قسم علم وظائف الأعضاء ومكتب نائب مدير الجامعة للأبحاث، جامعة كاليفورنيا في لوس انجليس (NLW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microscope Olympus BX50W (Upright)
Amplifier Axon Instruments Axoclamp 200B
A-D converter Computer Interference Corp. Digidata ITC-18
Cooled CCD camera PCO Computer Optics Sensicam
Xenon lamp Sutter Instruments Co.
GFP filter set Chroma Technologies
Imaging Software Intelligent Imaging Innovations Slidebook software
Electrophysiology Data Acquisition Software Axon Instruments Axograph software
Electrophysiology Data Acquisition Software AD Instruments Inc. PowerLab
Headstage for electrophysiology Axon Instruments CV 203BU
Micromanipulator Sutter Instrument Co MP-285
Recording Chamber Platform Warner Instrument Corp. P1
Recording Chamber Warner Instrument Corp. RC-26G
Electrode Puller Sutter instruments P87
Filament for electrode puller Sutter Instruments FB330B 3.0 mm wide trough filament
1.5 mm glass capillaries World Precision Instruments 1B150-4 Microelectrode for recording
Syringe Becton Dickinson 309586 3 ml
MS-222 Sigma E10521-10G Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt
Fish saline mM: 134 NaCl; 2.9 KCl; 2.1 CaCl2; 1.2 MgCl2; 10 HEPES
Electrode solution (loose-patch) mM: 150 NaCl; 3.5 KCl; 2.5 CaCl2; 1.3 MgCl2; 10 HEPES; 10 glucose
Electrode solution (whole-cell patch) mM: 112.5 K-gluconate; NaCl; 17.5 KCl; 0.5 CaCl2; 1 MgCl2; 5 MgATP; 1 EGTA; 10 HEPES; 1 GTP; 0.1 leupeptin;10 phospho-creatine

References

  1. Kah, O., Lethimonier, C., Lareyre, J. J. Gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) in the animal kingdom. J. Soc. Biol. 198 (1), 53-60 (2004).
  2. Ramakrishnan, S., Wayne, N. L. Social cues from conspecifics alter electrical activity of gonadotropin-releasing hormone neurons in the terminal nerve via visual signals. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 297 (1), R135-R141 (2009).
  3. Abe, H., Oka, Y. Mechanisms of neuromodulation by a nonhypophysiotropic GnRH system controlling motivation of reproductive behavior in the teleost. 57 (6), 665-674 (2011).
  4. Oka, Y. Tetrodotoxin-resistant persistent Na+ current underlying pacemaker potentials of fish gonadotrophin-releasing hormone neurones. J. Physiol. 482 (Pt. 1), 1-6 (1995).
  5. Zhao, Y., Wayne, N. L. Effects of Kisspeptin1 on Electrical Activity of an Extrahypothalamic Population of Gonadotropin-Releasing Hormone Neurons in Medaka. PLoS One. 7 (5), e37909 (2012).
  6. Wayne, N. L., et al. Whole-cell electrophysiology of gonadotropin-releasing hormone neurons that express green fluorescent protein in the terminal nerve of transgenic medaka (Oryzias latipes). Biol. Reprod. 73 (6), 1228-1234 (2005).
  7. Okubo, K., et al. Forebrain gonadotropin-releasing hormone neuronal development: insights from transgenic medaka and the relevance to X-linked Kallmann syndrome. Endocrinology. 147 (3), 1076-1084 (2006).
  8. Okubo, K., et al. A novel form of gonadotropin-releasing hormone in the medaka, Oryzias latipes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 276 (1), 298-303 (2000).
  9. Ramakrishnan, S., et al. Acquisition of spontaneous electrical activity during embryonic development of gonadotropin-releasing hormone-3 neurons located in the terminal nerve of transgenic zebrafish (Danio rerio). Gen. Comp. Endocrinol. 168 (3), 401-407 (2010).
  10. Abraham, E., et al. Targeted gonadotropin-releasing hormone-3 neuron ablation in zebrafish: effects on neurogenesis, neuronal migration, and reproduction. Endocrinology. 151 (1), 332-340 (2010).
  11. Wayne, N. L., Kuwahara, K. Beta-endorphin alters electrical activity of gonadotropin releasing hormone neurons located in the terminal nerve of the teleost medaka (Oryzias latipes. Gen. Comp. Endocrinol. 150 (1), 41-47 (2007).
  12. Oka, Y. Three types of gonadotrophin-releasing hormone neurones and steroid-sensitive sexually dimorphic kisspeptin neurones in teleosts. J. Neuroendocrinol. 21 (4), 334-338 (2009).
  13. Molleman, A. . Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , (2003).

Play Video

Cite This Article
Zhao, Y., Wayne, N. L. Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish. J. Vis. Exp. (74), e50312, doi:10.3791/50312 (2013).

View Video