Registro da atividade elétrica dos neurônios identificados no cérebro intacto de peixes transgénicos

Summary

Neste vídeo, vamos demonstrar como para registrar a atividade elétrica dos neurônios individuais identificados em uma preparação do cérebro inteiro, o que preserva os circuitos neurais complexos. Usamos peixe transgênico no qual hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH) neurônios são geneticamente marcadas com uma proteína fluorescente para identificação na preparação cérebro intacto.

Abstract

Compreendendo a fisiologia da célula de circuitos neurais que regulam comportamentos complexos é muito maior usando sistemas de modelo em que este trabalho podem ser realizados em uma preparação cérebro intacto, onde o circuito neural do SNC permanece intacta. Usamos peixe transgênico no qual hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH) neurônios são geneticamente marcados com proteína fluorescente verde para identificação no cérebro intacto. Os peixes têm múltiplas populações de neurónios da GnRH, e as suas funções são dependentes da sua localização no cérebro e o gene de GnRH que expressam ^um. Nós nos concentramos em nossa demonstração GnRH3 neurônios localizados nos nervos terminais (TN) associados aos bulbos olfatórios usando o cérebro intacto de transgênicos medaka peixe (Figura 1B e C). Estudos sugerem que medaka TN-GnRH3 neurónios são neuromodulador, agindo como um transmissor de informação a partir do ambiente externo para o sistema nervoso central; they não desempenham um papel direto na regulação das funções hipofisário-gonadal, assim como o bem conhecido hipotálamo GNRH1 neurônios ^{2, 3.} padrão A tônica do potencial de ação espontâneo disparo de TN-GnRH3 neurônios é uma propriedade intrínseca ^4-6, a freqüência de que é modulada por pistas visuais de ^dois membros da mesma espécie e do neuropeptídeo Kisspeptin 1 ^5. Neste vídeo, usamos uma linha estável de transgênicos medaka em que TN-GnRH3 neurônios expressam um transgene contendo a região promotora de Gnrh3 ligado ao aumento da proteína verde fluorescente ⁷ para mostrar a você como identificar neurônios e monitorar a atividade elétrica em todo o cérebro preparação ^6.

Protocol

1. Dissecação de cérebros de adultos Medaka Anestesiar adulto do sexo masculino ou do sexo feminino (Figura 1A) por imersão em 5 ml MS-222 (150 mg / L, pH 7,4), aguarde alguns minutos após movimentos brânquias cessaram antes de decapitar. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use da Universidade da Califórnia-Los Angeles. Decapitar o peixe em solução salina peixe na extremidade caudal do opérculo com uma tesoura em um diâmetro …

Representative Results

Um exemplo de grupos bilaterais de GFP marcadas com TN-GnRH3 neurónios do cérebro excisada de medaka peixes são apresentados nas Figuras 1B e 1C. Cada cluster contém cerca de 8-10 neurônios GnRH. As actividades neuronais espontâneas do destino TN-GnRH3 foram registrados no modo de corrente-braçadeira (I = 0), com taxas de queima típicas de 0,5-6 Hz. O padrão de ação potencial de queima é tipicamente um padrão tônico ou batendo, com um intervalo bastante regular interspike….

Discussion

GnRH 3: GFP peixes transgênicos oferecem modelos exclusivos para estudar os mecanismos neurofisiológicos subjacentes à integração e regulamentação de controle central de comportamentos que estão direta e indiretamente envolvidos na reprodução ^{3, 8-10} neuronal. Uma das vantagens significativas deste sistema modelo é que muitas GnRH3 neurónios expressando GFP estão perto da superfície ventral do cérebro, o que permite um acesso relativamente fácil para os neurónios para o registo elect…

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope	Olympus		BX50W (Upright)
Amplifier	Axon Instruments		Axoclamp 200B
A-D converter	Computer Interference Corp.		Digidata ITC-18
Cooled CCD camera	PCO Computer Optics		Sensicam
Xenon lamp	Sutter Instruments Co.
GFP filter set	Chroma Technologies
Imaging Software	Intelligent Imaging Innovations		Slidebook software
Electrophysiology Data Acquisition Software	Axon Instruments		Axograph software
Electrophysiology Data Acquisition Software	AD Instruments Inc.		PowerLab
Headstage for electrophysiology	Axon Instruments		CV 203BU
Micromanipulator	Sutter Instrument Co	MP-285
Recording Chamber Platform	Warner Instrument Corp.		P1
Recording Chamber	Warner Instrument Corp.		RC-26G
Electrode Puller	Sutter instruments		P87
Filament for electrode puller	Sutter Instruments	FB330B	3.0 mm wide trough filament
1.5 mm glass capillaries	World Precision Instruments	1B150-4	Microelectrode for recording
Syringe	Becton Dickinson	309586	3 ml
MS-222	Sigma	E10521-10G	Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt
Fish saline			mM: 134 NaCl; 2.9 KCl; 2.1 CaCl2; 1.2 MgCl2; 10 HEPES
Electrode solution (loose-patch)			mM: 150 NaCl; 3.5 KCl; 2.5 CaCl2; 1.3 MgCl2; 10 HEPES; 10 glucose
Electrode solution (whole-cell patch)			mM: 112.5 K-gluconate; NaCl; 17.5 KCl; 0.5 CaCl2; 1 MgCl2; 5 MgATP; 1 EGTA; 10 HEPES; 1 GTP; 0.1 leupeptin;10 phospho-creatine