Permanent Cerebral karokklusion<em> Via</em> Dobbelt Ligature og transection

Summary

Vi beskriver en meget reproducerbar metode til permanent okklusion af en gnaver større cerebral blodkar. Denne teknik kan udføres med meget lille perifer skade minimal blodtab, en høj grad af langsigtede overlevelse, og konsekvent infarktvolumen svarer til den humane kliniske befolkning.

Abstract

Slagtilfælde er en førende årsag til død, invaliditet og samfundsøkonomisk tab på verdensplan. Hovedparten af alle slagtilfælde skyldes en afbrydelse i blodgennemstrømning (iskæmi) ^1.. Midterste cerebral arterie (MCA) giver et stort flertal af blod til den laterale overflade af cortex ^2, er den mest almindelige sted for humant slagtilfælde ^3, og iskæmi inden for dens område kan resultere i omfattende dysfunktion eller død ^1,4,5. Overlevende fra iskæmisk slagtilfælde ofte lider tab eller afbrydelse af motordrevne evner, sensoriske underskud, og infarkt. I et forsøg på at fange disse vigtige egenskaber for slagtilfælde, og derved udvikle en effektiv behandling, er en stor vægt lagt på dyremodeller af iskæmi i MCA.

Her præsenterer vi en metode til permanent okklusion en cortical overflade blodkar. Vi vil præsentere denne metode ved hjælp af et eksempel på en relevant tillukning af blodkar, der modellerer den mest almindelige type, placering og OutCome af menneskets slagtilfælde, permanent midterste cerebral arterieokklusion (pMCAO). I denne model, kirurgisk udsætter vi MCA i den voksne rotte og efterfølgende okkludere via dobbelt ligatur og overskæring af karret. Dette pMCAO blokerer proximale kortikale gren af ​​MCA, forårsager iskæmi i alle MCA kortikale område, en stor del af cortex. Denne metode til okklusion kan også anvendes til at okkludere mere distale dele af corticale fartøjer for at opnå mere fokal iskæmi rettet mod et mindre område af cortex. De primære ulemper ved pMCAO er at den kirurgiske procedure er lidt invasiv som en lille kraniotomi for at få adgang MCA, selvom dette resulterer i minimal vævsskade. De primære fordele ved denne model er imidlertid: stedet for okklusion er veldefineret, graden af ​​reduktion af blodgennemstrømningen er konsistent, funktionel og neurologisk svækkelse sker hurtigt, infarktstørrelse er konsistent, og den høje overlevelse muliggør lang Udtrykket kronisk vurdering.

Introduction

For at fremkalde iskæmiske tilstande som effektivt efterligner human iskæmisk slagtilfælde, er flere dyr takts modeller almindeligt anvendt, med varierende mængder af infarkt resulterende. I photothrombotic modellen hjernen bestråles gennem den intakte kraniet ved laserbelysning efter intravenøs injektion af et lysfølsomt stof (såsom rose-bengal), hvilket resulterer i fotokemisk koagulation, blokering af de bestrålede fartøjer og iskæmi i det omgivende væv ^{6, 7..} Photothrombosis kan resultere i meget små, isolerede områder af infarkt og anvendes typisk som et middel til modellering "mini-slagtilfælde", eller "mikro-slagtilfælde".

Jo mere udbredt teknik til at inducere iskæmisk slagtilfælde, især i midterste cerebrale arterie (MCA), er det intraluminale monofilament model ^8, hvor et filament er kirurgisk indført i den ydre carotidarterie og fremføres indtil spidsen aflukker bunden af MCA. A primary udfordring intraluminale glødetråd okklusion er den høje dødelighed (70%, når MCA okkluderes i 3 timer, et relevant tidspunkt for slagtilfælde forskning) ^9.. Andre problemer med den metode, omfattede mulige subaraknoidalblødning, ufuldstændige okklusion, og variable infarktvolumen ^10,11. Denne model resulterer i en udstrakt grad af infarkt i både cortex og subcortically ¹² og modeller en massiv menneskelig slagtilfælde.

Selv om både mikro-og massive takts modeller er vigtige, menneskelige slagtilfælde er typisk et sted i mellem. I store kliniske studier, slagtilfælde infarkt spænder i størrelse fra 28 til 80 cm ^3, hvilket svarer til 4,5 til 14% af den ipsi-ishemic halvkugle ^9.. Til sammenligning. Vores rotte pMCAO infarktstørrelse spænder fra ca 9-35 mm ^3, der udgør 3 til 12% af den ipsi-ishemic halvkugle Vores pMCAO model derfor ligner menneskelige iskæmisk slagtilfælde infarktvolumener i procent af hjernensvolumen.

Ud over at modellere strukturelle skader af slagtilfælde, pMCAO resultater i funktionelle og adfærdsmæssige underskud svarende til den menneskelige tilstand. Som minimum ^en effektiv model for slagtilfælde resultater i bevægelse underskud kontralaterale til slagtilfælde skader ^13-15, tab eller forstyrrelser af motorisk og sensorisk funktion ^16,17, tab eller afbrydelse af fremkaldte neuronal aktivitet ^16,18, reduktioner i cerebral blodgennemstrømning ^{19 20,} og infarkt ^21,22. Derfor vores pMCAO modeller en alvorlig okklusion af MCA resulterer i fysisk handicap, tab af funktion i den sensoriske cortex (og tilstødende cortex), forstyrrelse af neuronal aktivitet, en alvorlig reduktion i MCA blodgennemstrømning, og infarkt-kendetegnende attributter iskæmisk slagtilfælde ^{23 -25,} derfor tjener som en effektiv model for menneskelig slagtilfælde.

Proceduremæssigt, pMCAO indebærer en lille kraniotomi, hvor vi forsigtigt fjerne kraniet og dura fraen 2 x 2 mm "kirurgisk vindue" over det første (M1) segment af MCA, lige før den primære tvedeling af MCA ind i de forreste og bageste kortikale grene (figur 1A og 1B). Vi passerer en halv kurve reverse skære sutur nål og tråd (6-0 silke) gennem pial lag i hjernehinden, under MCA og over kortikale overflade (se tabel af specifikke reagenser og udstyr til de kirurgiske forsyninger, der er nødvendige for at udføre pMCAO ). Vi derefter binde en dobbelt ligatur, spænd de to knob omkring MCA, og transektere skibet mellem de to knob. Den dobbelte ligatur og overskæring gennem M1 sker lige distalt for lenticulostriate forgrening, således at kun de cortikale grene af MCA er påvirket-således kun kortikale infarkt (ingen subkortikale skade) forekommer ^26,27 (fig. 2). Selvom menneskelig slagtilfælde involverer ofte subkortikale infarkt, modellering dette i gnavere kræver øget invasivitet (okklusion cerebrale fartøjer inden kortikale Branching kræver adgang arterier via halspulsåren i nakken og nødvendiggør yderligere tillukning) i teknik og øget variabilitet i infarktstørrelse. Modellen er beskrevet her kan ikke udføres mere proksimalt som adgang til tidligere grene af MCA ikke er mulig via en simpel kraniotomi. Mens det kan være kirurgisk muligt at fremkalde en subkortikale infarkt via pMCAO ville okklusion medføre en særdeles invasiv procedure og er derfor ikke ideel.

Effektiviteten af okklusion kan bekræftes via laser Doppler, eller laser speckle billedbehandling ^12,24,25 (fig. 3), eller histologisk post mortem (figur 2). Det skal bemærkes, at tidligere forskning har vist, at sensorisk stimulation kan spille en vigtig rolle i udviklingen og resultatet af infarkt, giver beskyttelse mod skader, når det administreres inden 2 timer i pMCAO og forårsager en stigning i slagtilfælde skader, når det administreres ved 3 timer efter pMCAO ^24,25,28. Vi har bekræftet, at ved 5 timer efter pMCAO, stimulation ikke længere har en effekt på resultat (upublicerede data). Derfor bør sensorisk stimulation af emner minimeres i 5 timer efter pMCAO at opnå infarktvolumener med minimal variation. Tilsvarende har vores gruppe kører "ubehandlede kontroller" af denne type ved at holde rotter bedøvet i 5 timer efter pMCAO, i mørke, med minimal sensorisk stimulation, og udtrykkeligt ingen whisker stimulation.

Det skal endvidere bemærkes, at lejlighedsvis variation i MCA struktur, herunder overdreven forgrening, flere primære segmenter, eller fravær af kommunikerende arterier kan forekomme ved en frekvens på 10 til 30% i mandlige voksne Sprague Dawley rotter ^29,30. Hvis abnormiteter i MCA overholdes, er det tilrådeligt ikke at bruge det pågældende emne som at tilføje dyr med sådanne vaskulære abnormiteter vil øge infarkt variabilitet.

Derudover er der flere praktiske aspekter af our procedure, der gør dette okklusion metode fordelagtigt for slagtilfælde undersøgelse. Først kan suturer placeres rundt om arterien, men ikke strammet for at indsamle en baseline vurdering, efterfulgt af post-iskæmisk vurdering efter ligatur og transection. På denne måde, er kirurgisk forberedelse nødvendig for okklusionen kontrolleres effektivt til, inden emner. Fordi fag kan forblive stationære eller inden for en stereotaktisk ramme hele okklusion, er det muligt at foretage eksperimentel vurdering af hvert emne før, under og efter okklusion uden at flytte motivet eller forstyrre nogen eksperimentelle udstyr i brug ^25,28. Desuden er denne procedure resulterer i en meget lav dødelighed, selv inden alderen gnaver fag 21-24 måneder (svarende til en ældre menneske) ^31, og kan derfor anvendes til at vurdere slagtilfælde behandlinger i rotter, nærmere modellere mest almindelige aldersgruppe af slagtilfælde syge ^25,28. Vessel transection også tjener flere praktiske formål. Fraværet af blødning efter transection bekræfter, at skibet var helt tilstoppet ved begge ligaturer sites. Derudover overskæring sikrer en permanent afbrydelse af blodgennemstrømningen. Endelig overskæring sikrer, at enhver blodgennemstrømningen påvist i de distale dele af den okkluderede fartøj skal komme fra en alternativ kilde.

Endelig, selv om vi specifikt beskrive denne okklusion teknik til MCA i dette manuskript og video, kan den samme dobbelte ligatur transection teknik anvendes på enhver cerebral fartøj, der kan tilgås via craniotomy. Vores laboratorium, for eksempel, udnyttes pMCAO i samarbejde med flere andre permanente tillukning af distale MCA afdelinger for at blokere både primær og sikkerhedsstillelse blodgennemstrømningen ²⁴ på en måde, der svarer til metoder, der skal selektivt fremkalde iskæmi inden for den primære somatosensoriske cortex ^32..

Sammenfattende thans metode til permanent okklusion, som anvendes til MCA tæt modeller tre primære facetter af menneskelig iskæmisk slagtilfælde: den mest almindelige placering (MCA), type (iskæmi), og graden af ​​skader (infarkt) i forbindelse med den humane kliniske litteratur for slagtilfælde. Desuden kan denne metode til okklusion anvendes på en enkelt eller flere okklusion steder i hele hjernen, og kan udføres i alderen individer med en høj overlevelsesprocent. I betragtning af den dynamiske, permanent og relativt invasiv karakter af denne okklusion, udgør denne teknik et supplerende værktøj for prækliniske forskere evaluere nye metoder til beskyttelse mod og behandling af slagtilfælde.

Protocol

1.. Kom godt i gang: Nødvendige kirurgiske instrumenter Se figur 4. Tandlægebor (Kavo Dental Equipment, Model: UMXL-TM), 2-bit bore, og 3-bit bore To ~ 30 gauge kanyler Savtakket pincet, buet spids valgfri (kan være nyttigt, men ikke afgørende) To fine spids pincet bidetang Suturtråd Micro saks 2.. Oprettelse af Kirurgisk Window Anæstesi: Procedurer er i…

Representative Results

Vellykket okklusion af et fartøj kan bekræftes ved hjælp af laser speckle imaging (LSI) blandt andet blodstrømningshastigheder billeddannende teknikker. Blodgennemstrømningen i de store kortikale grene af MCA skulle falde til ~ 25% af baseline eller mindre efter okklusion afhængigt af støjniveauet i registreringssystemet og følsomhed af teknikken. Se figur 3 for en repræsentativ LSI billede af et segment af en cortical gren af MCA før og efter MCA tilstopning. Når den beskrev…

Discussion

Denne protokol blev udviklet med henblik på at fremkalde iskæmi i gnaver cortex, og at gøre det med minimal perifer betydning for eksperimentelle fag. Den dobbelte okklusion og transection metode giver mulighed for visuel bekræftelse af, at fartøjet er blevet permanent tillukket og kan udføres uden overdreven invasion eller vævsskade, og med en høj overlevelsesrate. Denne okklusion protokol kan anvendes på enhver kortikale fartøj, der kan tilgås via kraniotomi for at fremkalde iskæmi inden for et specifikt c…

Materials

Name of the equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Extra Fine Graefe Forceps – 0.5 mm Tips Slight Curve (1)	Fine Science Tools	11151-10
Ceramic Coated Dumont #5 Forceps (2)	Fine Science Tools	11252-50
Extra Fine Bonn Scissors, straight (1)	Fine Science Tools	14084-08
Round 3/8 (16 mm) Suture Needles	Fine Science Tools	12050-02
6-0 Braided Silk Suture	Fine Science Tools	NC9071061 Harvard Apparatus No.:510461
30 gauge needle, ½” length	Fine Science Tools	NC9867376 No.:ZT-5-030-5-L/COL