Permanent Cerebral kärlocklusion<em> Via</em> Dubbel Ligature och transektion

Summary

Vi beskriver en mycket reproducerbar metod för permanent tillslutning av en gnagare större cerebral blodkärl. Denna teknik kan genomföras med mycket lite perifera skador, minsta blodförlust, en hög frekvens av långsiktig överlevnad, och konsekvent infarktvolymen proportion till den humana kliniska populationen.

Abstract

Stroke är en ledande orsak till dödsfall, invaliditet och samhällsekonomiska världsomspännande förlust. Majoriteten av alla slag uppstå ett avbrott i blodflödet (ischemi) ^1. Middle cerebral artär (MCA) levererar en stor majoritet av blod till den laterala ytan av hjärnbarken ^2, är den vanligaste platsen för mänsklig stroke ^3, och ischemi inom dess territorium, kan resultera i omfattande dysfunktion eller död ^1,4,5. Överlevande från ischemisk stroke drabbas ofta förlust eller störning av motoriska funktioner, sensoriska underskott, och infarkt. I ett försök att fånga dessa viktiga egenskaper hos stroke, och därigenom utveckla en effektiv behandling, är en stor tonvikt på djurmodeller för ischemi i MCA.

Här presenterar vi en metod för permanent tillsluta en kortikala kärlyta blod. Vi kommer att presentera den här metoden med ett exempel på en relevant kärlocklusion som modellerar den vanligaste typen, plats, och outcome av mänsklig stroke, permanent mellersta cerebral artär ocklusion (pMCAO). I denna modell, utsätter vi kirurgiskt MCA i vuxen råtta och därefter täppa via dubbel ligatur och transektion av fartyget. Detta pMCAO blockerar den proximala kortikala gren av MCA, vilket orsakar ischemi i alla MCA kortikal territorium, en stor del av hjärnbarken. Denna metod för ocklusion kan också användas för att ockludera mer distala delarna av kortikala kärl för att uppnå mer fokal ischemi rikta en mindre region av cortex. De primära nackdelarna med pMCAO är att det kirurgiska ingreppet är något invasiv som en liten kraniotomi krävs för att använda MCA, även om detta resulterar i minimal vävnadsskada. Den främsta fördelen med denna modell är emellertid: platsen för ocklusion är väl definierad, graden av blodflöde minskning är konsekvent, funktionell och neurologisk påverkan sker snabbt, är infarktstorlek konsekvent, och den höga graden av överlevnad möjliggör lång- Termen kronisk bedömning.

Introduction

För att inducera ischemiska förhållanden som effektivt efterliknar human ischemisk stroke, är flera djur stroke modeller ofta används, med varierande volymer av infarkt följd. I photothrombotic modellen, är hjärnan bestrålas genom skallbenet med laserbelysning efter intravenös injektion av en ljuskänslig substans (t.ex. rose-bengal), vilket resulterar i fotokemisk koagulation, blockering av bestrålade fartyg, och ischemi i den omgivande vävnaden ^{6, 7.} Photothrombosis kan resultera i mycket små, isolerade områden i infarkt och används vanligen som ett medel för modellering "mini-stroke", eller "mikro-stroke".

Ju mer allmänt antagits teknik för inducering av ischemisk stroke, särskilt i arteria cerebri media (MCA), är det intraluminala monofilament modell ^8, i vilken ett filament är kirurgiskt införas i den yttre halspulsådern och förs fram tills spetsen ockluderar basen av MCA. En primary utmaning intraluminal filament ocklusion är den höga dödligheten (70% när MCA är tilltäppt under 3 timmar, en relevant tidpunkt för stroke forskning) ^9. Andra frågor med metoden inkluderade möjligt subaraknoidalblödning, ofullständig ocklusion, och variabel infarktvolymen ^10,11. Denna modell resulterar i en omfattande grad av infarkt i både cortex och subcortically ^12, och modeller en massiv mänsklig stroke.

Även om både mikro-och massiv stroke modeller är viktiga, mänskliga stroke är vanligtvis någonstans mellan. I stora kliniska studier, stroke infarkt varierar i storlek från 28 till 80 cm ^3, som översätts till 4,5-14% av ipsi-ishemic halvklotet ^9. I jämförelse, våra råtta pMCAO infarktstorlek varierar mellan ungefär 9-35 mm ^3, som utgör 3-12% av den ipsi-ishemic halvklotet. Vår pMCAO modell, alltså liknar mänskliga ischemisk stroke infarkt volymer av andelen hjärnanvolym.

Förutom att modellera strukturella skador av stroke, pMCAO resulterar i funktionella och beteendestörningar som liknar människans villkor. Åtminstone en effektiv modell för stroke resulterar i rörelse underskott kontralaterala till stroke skada ^13-15, förlust eller avbrott i motorisk och sensorisk funktion ^16,17, förlust eller avbrott i framkallade neuronal aktivitet ^16,18, minskningar av cerebralt blodflöde ^{19, 20,} och infarkt ^21,22. Följaktligen våra pMCAO modeller en allvarlig ocklusion av MCA resulterar i fysiskt handikapp, förlust av funktion i det sensoriska cortex (och angränsande cortex), störningar av neuronal aktivitet, en kraftig minskning av MCA blodflöde, och infarkt-kännemärke attribut ischemisk stroke ^{23 -25,} därför fungerar som en effektiv modell av mänsklig stroke.

Procedurmässigt innebär pMCAO en liten kraniotomi där vi försiktigt bort skallen och dura frånen 2 x 2 mm "kirurgisk fönster" över den initiala (M1) segment av MCA, precis före den primära bifurkation av MCA in i de främre och bakre kortikala grenar (fig. 1A och 1B). Vi passerar en halv kurva omvänd nål skärande sutur och tråd (6-0 silke) genom pial skiktet i hjärnhinnan, nedan MCA och ovanför kortikala ytan (se tabell av särskilda reagenser och utrustning för de kirurgiska förnödenheter som behövs för att utföra pMCAO ). Vi sedan knyta en dubbel ligatur, dra åt de två knop runt MCA, och transekt kärlet mellan de två knop. Den dubbla ligatur och transektion genom M1 inträffar strax distalt till lenticulostriate förgrening, så att endast de bark grenar av MCA påverkas-sålunda endast kortikal infarkt (ingen subkortikal skada) förekommer ^26,27 (figur 2). Även människans stroke innebär ofta subcortical infarkt, modellera detta i gnagare kräver ökad spridningsförmåga (occluding cerebrala kärl före kortikala Branching kräver åtkomst artärer via halspulsådern i halsen och nödvändiggör ytterligare inneslutningar) i teknik och ökad variation i infarktstorlek. Den modell som beskrivs här kan inte göras mer proximalt som tillgång till tidigare grenar av MCA är inte möjlig via en enkel craniotomy. Även om det kan vara kirurgiskt möjligt att inducera en subcortical infarkt via pMCAO skulle ocklusion medför en extremt invasiv förfarande och är därför inte idealiska.

Effektiviteten av ocklusion kan bekräftas via laser Doppler, eller laser speckle avbildning ^12,24,25 (figur 3), eller histologiskt obduktioner (Figur 2). Det bör noteras att tidigare forskning har visat att sensorisk stimulering kan spela en viktig roll i utvecklingen och resultatet av infarkt, som ger skydd mot skador vid administrering inom 2 h av pMCAO och orsakar en ökning av stroke skador när de administreras vid 3 h efter pMCAO ^24,25,28. Vi har bekräftat att 5 h efter pMCAO, stimulering inte längre har en effekt på resultatet (opublicerade data). Därför bör sensorisk stimulering av ämnen minimeras i 5 timmar efter pMCAO att få infarkt volymer med minimal variabilitet. Följaktligen driver vår grupp "obehandlade kontroller" av denna typ genom att hålla råttor bedövades för 5 h efter pMCAO, i mörker, med minimal sensorisk stimulering, och uttryckligen ingen whisker stimulering.

Det bör vidare noteras att tillfällig variation i MCA struktur, inklusive överdriven förgrening, multipla primära segment, eller frånvaron av kommunicerande artärerna kan uppstå vid en frekvens på 10 till 30% hos manliga vuxna Sprague Dawley ^29,30. Om avvikelser i MCA observeras, är det lämpligt att inte använda just det ämnet som tillsats djur med sådana kärlmissbildningar ökar infarkt variabilitet.

Dessutom finns det flera praktiska aspekter av oUR förfarande som gör denna ocklusion metod fördelaktig för stroke utredning. Först får suturer placeras runt artären men inte skärpas i syfte att samla in en baslinje bedömning, följt av post-ischemisk bedömning efter ligatur och transektion. På detta sätt är kirurgisk förberedelse nödvändig för ocklusion effektivt kontrolleras för, inom försökspersoner. Eftersom patienter kan förbli stationär eller inom en stereotaktisk ram under ocklusion, är det möjligt att genomföra experimentell utvärdering av varje ämne före, under, och efter ocklusion utan att flytta föremål eller störa någon experimentell utrustning i bruk ^25,28. Dessutom, denna procedur resulterar i en mycket låg dödlighet, även inom äldre gnagare försökspersoner 21-24 månaders ålder (motsvarande en äldre människa) ^31, och kan därför användas för att utvärdera stroke behandlingar hos råttor som närmare modellera de vanligaste åldersgrupp av stroke drabbade ^25,28. Vessel transection tjänar också flera praktiska syften. Frånvaron av blödning efter transektion bekräftar att fartyget var helt blockerad vid båda ligaturer platserna. Dessutom säkerställer transection ett permanent avbrott i blodflödet. Slutligen garanteras transection att varje blodflödet detekteras i de bortre delarna av det tilltäppta kärlet måste komma från en alternativ källa.

Slutligen, även om vi specifikt beskriva denna ocklusion teknik för MCA i detta manuskript och video, kan samma dubbel ligatur transection teknik tillämpas på alla cerebrala kärl som kan nås via kraniotomi. Vårt laboratorium, till exempel, används pMCAO tillsammans med flera andra fasta inneslutningar av distala MCA grenar för att blockera både primära och säkerheter blodflödet ²⁴ på ett sätt som liknar tekniker avsedda att selektivt framkalla ischemi inom den primära hjärnbarken ^32.

Sammanfattningsvis thans metod för permanent ocklusion som tillämpas på MCA modeller nära tre primära aspekter av mänskligt ischemisk stroke: den vanligaste platsen (MCA), typ (ischemi), och graden av skada (infarkt) associerad med den humana kliniska litteraturen av stroke. Dessutom kan denna metod för ocklusion tillämpas på enkla eller multipla ocklusion platser i hela hjärnan, och kan utföras i åldrade individer med en hög frekvens av överlevnad. Med tanke på den dynamiska, permanent, och relativt icke-invasiv karaktär denna ocklusion, representerar denna teknik ytterligare ett verktyg för prekliniska forskare utvärderar nya metoder för skydd mot och behandling av stroke.

Protocol

Ett. Komma igång: Krävs kirurgiska instrument Se Figur 4 Tandläkarborrmaskiner (Kavo Dental Equipment, Modell: UMXL-TM), 2-bitars borr, och 3-bitars borr Två ~ 30 gauge injektionssprutor Tandad pincett, böjd spets tillval (kan vara bra men inte nödvändigt) Två fin spets pincett avbitare Suturtråd Micro sax 2. Skapa Kirurgiska Window Anestesi: förfara…

Representative Results

Framgångsrik ocklusion av ett fartyg kan bekräftas med hjälp av laser speckle avbildning (LSI) bland andra avbilda blodflöde tekniker. Blodflödet i de stora kortikala grenar av MCA skulle sjunka till ~ 25% av utgångsvärdet eller mindre efter ocklusion beroende på bullernivån i inspelningen systemet och känslighet av tekniken. Se figur 3 för en representativ LSI bild av ett segment av en kortikal gren av MCA före och efter MCA ocklusion. När den beskrivna ocklusion teknik an…

Discussion

Detta protokoll har utvecklats i syfte att inducera ischemi inom gnagare cortex, och att göra det med minimal perifer påverkan på försökspersoner. Den dubbla ocklusion och transection metod möjliggör visuell bekräftelse på att fartyget permanent har tilltäppt, och kan utföras utan överdriven invasion eller vävnadsskada, och med en hög överlevnad. Denna ocklusion protokoll kan tillämpas på alla kortikala kärl som kan nås via kraniotomi för att inducera ischemi inom ett specifikt kortikal domän. Vidar…

Materials

Name of the equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Extra Fine Graefe Forceps – 0.5 mm Tips Slight Curve (1)	Fine Science Tools	11151-10
Ceramic Coated Dumont #5 Forceps (2)	Fine Science Tools	11252-50
Extra Fine Bonn Scissors, straight (1)	Fine Science Tools	14084-08
Round 3/8 (16 mm) Suture Needles	Fine Science Tools	12050-02
6-0 Braided Silk Suture	Fine Science Tools	NC9071061 Harvard Apparatus No.:510461
30 gauge needle, ½” length	Fine Science Tools	NC9867376 No.:ZT-5-030-5-L/COL