Прижизненные микроскопия для визуализации субклеточных структур в живых мышей, экспрессирующих флуоресцентные белки
Summary
Прижизненные микроскопия является мощным инструментом, который позволяет визуализации различных биологических процессов в живых животных. В этой статье мы представляем подробный метод визуализации динамику внутриклеточных структур, таких как секреторных гранул, в слюнных железах живых мышей.
Abstract
Здесь мы опишем процедуру для изображений субклеточных структур в живых грызунов, которая основана на использовании конфокальной микроскопии прижизненной. В качестве модельной органа, мы используем слюнных желез живых мышей, поскольку они обеспечивают ряд преимуществ. Во-первых, они могут быть легко подвергается чтобы обеспечить доступ к оптике и стабилизированный, чтобы облегчить уменьшение артефактов движения, обусловленного сердцебиение и дыхание. Это значительно облегчает изображений и отслеживания небольших субклеточных структур. Во-вторых, большинство клеточных популяций слюнных желез доступны от поверхности органа. Это позволяет использовать конфокальной микроскопии, который имеет более высокое пространственное разрешение, чем другие методы, которые были использованы для естественных изображений, таких как двухфотонного микроскопии. Наконец, слюнные железы можно легко манипулировать фармакологически и генетически, обеспечивая тем самым надежную систему для расследования биологические процессы на молекулярном уровне.
В этом исследовании мы ориентируемся на протокол, разработанный, чтобы следовать кинетики экзоцитоза секреторных гранул в ацинарных клеток и динамики апикальной мембране, где секреторные гранулы сплавить по стимуляции бета-адренорецепторов. В частности, мы использовали трансгенных мышей, которые совместно выражает цитозольную GFP и мембраны, ориентированных на пептид, слитый с флуоресцентным белком тандем-помидор. Однако процедуры, которые мы использовали, чтобы стабилизировать и изображение слюнных желез может быть распространен и на другие модели мыши, и в сочетании с другими подходами к этикетке в естественных условиях клеточные компоненты, что позволяет визуализировать разных внутриклеточных структур, таких как эндосомах, лизосом, митохондрий, и актина цитоскелета.
Introduction
В последние два десятилетия появление живой микроскопии и использование флуоресцентных белков привели к крупным прорывам на каждом клеточном процессе можно себе представить, тем самым развив наше понимание клеточной биологии 1. Это поле извлекает огромную пользу от использования млекопитающих клеточных культур, которые являются чрезвычайно мощные модели системы, особенно когда дело доходит до экспериментальных манипуляций. Тем не менее, они не часто предоставляют истинное представление о биологии сложных многоклеточных организмов 2. Этот вопрос начал решаться развития прижизненной микроскопии (ИВМ), который открыл дверь в расследовании ключевые биологические вопросы в таких областях, как нейробиологии, иммунологии и биологии опухолей 3. До сих пор большинство исследований, основанных на IVM были выполнены на уровне тканей и отдельных клеток, не предоставляя никакой информации о динамике субклеточных отсеков. В последнее время наша лаборатория и другиес разработали методы КБПБ способные изображений субклеточных структур в живых грызунов 4-7, 13-15 и позволяющих фармакологические и генетические манипуляции в естественных условиях. Этот подход был использован нами для изучения торговлей мембраны в естественных условиях, и, более конкретно эндоцитоза и регулируется экзоцитоза 6,7.
Наша экспериментальная модель система основана на разоблачения, стабилизирующие и визуализации подчелюстной слюнных желез (SGS) из анестезии грызунов. Выбор ИК качестве модели органа для IVM связано с тем, что железы были легко доступны, выполняя незначительные операции, может быть вовне без ущерба для их физиологию и стабилизированный, чтобы уменьшить артефактов движения из-за сердцебиение и дыхание. Кроме того, SGS может быть избирательно манипулировать генетически путем инъекции или вирусных или не-вирусные векторы, основанные через слюнной проток 8,9. Наконец, SGS являются экзокринных желез, состоящие из поляризованного epithelial клетки, которые формируют ацинусы и протоки, миоэпителиальных клеток и сложную население стромальных клеток. По этой причине, они являются отличным моделью для изучения экзоцитоза, эндоцитоз, доставка генов, и актина цитоскелета, как подчеркивается в наших последних исследований 10, и предлагают возможность изучить аспекты клеточной биологии, таких как клеточной полярности, деление клеток, клетки- сотовые узлы, и ионные каналы.
В этой статье мы подробно описать протокол изображений для достижения субклеточную резолюцию, в эпителии ИК живой мыши. В частности, мы покажем, как изображение секреторные гранулы в ацинарных клетках ПГ при регулируемом экзоцитоза. Как было показано ранее, при стимуляции с агонистов бета-адренорецепторов рецептора, секреторные гранулы сливаются с апикальной мембране и постепенно разрушаться, высвобождая свое содержимое в ацинозной канальцев 6. Наша цель заключается в предоставлении основные инструменты для исследователей с тinimal опыт в хирургических процедурах и обработке животного, так что они могут успешно выполнять IVM на субклеточном разрешении. Поскольку наиболее сложной частью в IVM является подготовка животного, здесь мы сосредоточимся на описании основных хирургических процедур, которые используются для выявления и иммобилизации ГХ без ущерба для их функцию. Что касается процедур, чтобы маркировать субклеточных структур, несколько стратегий, таких как системной доставки флуоресцентных зондов, использование трансгенных животных, или сочетание того и другого, были описаны в других 7,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Пока субклеточные структуры были отображены в основном в в пробирке (т.е. клеточные культуры) или в бывших естественных условиях (то есть орган-культур, срезы тканей, ацинарные препараты) модельных систем, которые часто не повторять характеристики неповрежденных живых тканей …
Acknowledgements
Это исследование было поддержано исследовательской программы Интрамурального НИЗ, Национального института стоматологических и черепно-лицевых исследований.
Materials
| Reagent | |||
| Isoflourane (Forane) | Baxter | 101936-40 | Handle under chemical hood |
| Ketamine (ketaved) | Fort Dodge Animal Health | 57457-034-10 | Stock solution 100 mg/ml |
| Xylazine (Anased) | Akorn, Decatur | 61311-481-10 | Stock solution 100 mg/ml |
| Neomycin/Polymyxin B | Bausch and Lomb | 24208-785-55 | Use to lubricate the eye of the mouse |
| Carbomer-940 | Ashalnd, Inc. | 4607-1 | |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279 | Add drop wise to prevent the solution to solidify |
| Isoproternol | Sigma-Aldrich | 16504 | Prepare fresh solutions in saline when needed. Stocks can be stored at -20 °C |
| Instrument | |||
| Isoflurane V 1.9 (Vaporizer) | Braintree Scientific | 190AF | |
| Portable Downdraft table equipped with HEPA filter | Hazard Technology | PDDT | |
| Heat lamp, Model HL1 | Braintree Scientific | HL-1 US | |
| MicroTherma 2T Thermometer | Braintree Scientific | TW2 | |
| Operating Scissors (11.5 cm straight | World Precision Instruments | 5003708-12 | |
| #7 curved tip tweezers | World Precision Instruments | 14187 | |
| Microscissors | World Precision Instruments | 503365 | |
| Black Braided Silk suture #4.0 | George & Tiemann & Co | 160-1219-4 | |
| Gauze sponges 2″ x 2″ | Tyco Healthcare | 9022 | |
| Lens cleaning tissue | Olympus | CL-TISSUE (M97) AX6476 |
References
- Lippincott-Schwartz, J. Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*). Annu Rev Biochem. 80, 327-332 (2011).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).
- Dunn, K. W., et al. Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 283, C905-C916 (2002).
- Masedunskas, A., Porat-Shliom, N., Weigert, R. Regulated exocytosis: novel insights from intravital microscopy. Traffic. 13, 627-634 (2012).
- Masedunskas, A., et al. Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13552-13557 (2011).
- Masedunskas, A., Weigert, R. Intravital two-photon microscopy for studying the uptake and trafficking of fluorescently conjugated molecules in live rodents. Traffic. 9, 1801-1810 (2008).
- Sramkova, M., Masedunskas, A., Parente, L., Molinolo, A., Weigert, R. Expression of plasmid DNA in the salivary gland epithelium: novel approaches to study dynamic cellular processes in live animals. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C1347-C1357 (2009).
- Sramkova, M., Najman, S., et al. . Current Frontiers and Perspectives in Cell Biology. , (2012).
- Masedunskas, A., et al. Everything you need to know about intravital microscopy: A practical guide on imaging intracellular structures in live animals. Bioarchitecture. 2, (2012).
- Masedunskas, A., Sramkova, M., Parente, L., Weigert, R. Intravital microscopy to image membrane trafficking in live rats. Methods Mol. Biol. 931, 153-167 (2013).
- Babbey, C. M., Ryan, J. C., Gill, E. M., Ghabril, M. S., Burch, C. R., Paulman, A., Dunn, K. W. Quantitative intravital microscopy of hepatic transport. Intravital. 1, 44-53 (2012).
- Rothstein, E. C., Nauman, M., Chesnick, S., Balaban, R. S. Multi-photon excitation microscopy in intact animals. J. Microsc. 222, 58-64 (2006).
- Klinger, A., Orzekowsky-Schroeder, R., von Smolinski, D., Blessenohl, M., Schueth, A., Koop, N., Huettmann, G., Gebert, A. Complex morphology and functional dynamics of vital murine intestinal mucosa revealed by autofluorescence 2-photon microscopy. Histochem. Cell Biol. 137, 269-278 (2012).
- Peter, B., Van Waarde, M. A., Vissink, A., s-Gravenmade, E. J., Konings, A. W. Degranulation of rat salivary glands following treatment with receptor-selective agonists. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 22, 330-336 (1995).
