حيوي داخلي المجهري للهياكل التصوير التحت خلوية في الفئران لايف تعرب عن البروتينات الفلورية
Summary
intravital المجهري هو أداة قوية تمكن التصوير العمليات البيولوجية المختلفة في الحيوانات الحية. في هذه المقالة، نقدم طريقة مفصلة لتصوير ديناميات الهياكل التحت خلوية، مثل حبيبات إفرازية، في الغدد اللعابية من الفئران الحية.
Abstract
نحن هنا وصف الإجراء لصورة هياكل التحت خلوية في القوارض الحية التي تقوم على استخدام intravital المجهري متحد البؤر. كجهاز نموذج، ونحن نستخدم الغدد اللعابية من الفئران الحية نظرا لأنها توفر العديد من المزايا. الأولى، فإنها يمكن أن تتعرض بسهولة لتمكين الوصول إلى البصريات، واستقرت لتسهيل الحد من الحركة الفنية بسبب ضربات القلب والتنفس. هذا يسهل بشكل كبير التصوير وتتبع هياكل التحت خلوية صغيرة. الثانية، فإن معظم السكان خلية من خلايا الغدد اللعابية يمكن الوصول إليها من سطح الجهاز. هذا يسمح باستخدام المجهر متحد البؤر التي لديها القرار المكانية أعلى من غيرها من التقنيات التي استخدمت لفي الجسم الحي التصوير، مثل اثنين من الفوتون المجهري. أخيرا، الغدد اللعابية يمكن التلاعب بها بسهولة عقاقيري وراثيا، وبالتالي توفير نظام قوي للتحقيق في العمليات البيولوجية على المستوى الجزيئي.
في هذه الدراسة ونحن نركز على بروتوكول صمم لمتابعة حركية من إيماس من حبيبات إفرازية في خلايا عنيبية وديناميات غشاء البلازما قمية حيث تلتحم الحبيبات الإفرازية على تحفيز مستقبلات بيتا الأدرينالية. على وجه التحديد، ونحن استخدام الماوس المعدلة وراثيا التي تشارك في تعرب عن GFP عصاري خلوي والببتيد التي تستهدف غشاء تنصهر مع بروتين فلوري جنبا إلى جنب، الطماطم. ومع ذلك، فإن الإجراءات التي استخدمناها لتحقيق الاستقرار وصورة الغدد اللعابية يمكن أن تمتد إلى نماذج الماوس الأخرى وإلى جانب لمناهج أخرى لتسمية في الجسم الحي المكونات الخلوية، مما يمكن تصور مختلف الهياكل التحت خلوية، مثل الإندوسومات، الجسيمات الحالة، الميتوكوندريا، و الهيكل الخلوي الأكتين.
Introduction
في العقدين الماضيين أدت ظهور المجهر الحية واستخدام البروتينات الفلورية لاختراقات كبرى على كل عملية الخلوية التي يمكن تخيلها، وبالتالي تعزيز فهمنا للبيولوجيا الخلية 1. وقد استفاد هذا المجال بشكل كبير من استخدام الثقافات خلايا الثدييات التي هي نموذج نظم قوية للغاية، لا سيما عندما يتعلق الأمر التلاعب التجريبية. ومع ذلك، فإنها غالبا ما لا توفر التمثيل الحقيقي للبيولوجيا الكائنات الحية متعددة الخلايا المعقدة 2. وقد بدأت هذه القضية التي يتعين معالجتها من خلال تطوير intravital المجهري (IVM) التي فتحت الباب أمام التحقيق الأسئلة البيولوجية الرئيسية في مجالات مثل علم الأعصاب، علم المناعة والأورام والبيولوجيا 3. حتى الآن، فإن معظم الدراسات على أساس الإدارة المتكاملة للنواقل أجريت على مستوى الأنسجة والخلايا الفردية، دون تقديم أي معلومات عن ديناميات مقصورات التحت خلوية. في الآونة الأخيرة، لدينا مختبر وغيرهاو قد وضعت تقنيات الإدارة المتكاملة للنواقل قادرة على التصوير الهياكل التحت خلوية في القوارض الحية 4-7، 13-15 والسماح التلاعب الدوائية والوراثية في الجسم الحي. وقد استخدم هذا النهج من قبلنا لدراسة الاتجار غشاء في الجسم الحي، وبشكل أكثر تحديدا الإلتقام وينظم إيماس 6،7.
ويستند نظامنا النموذج التجريبي على فضح، وتحقيق الاستقرار وتصوير الغدد اللعابية تحت الفك السفلي (اس جي اس) من القوارض تخدير. هو اختيار SGS كجهاز نموذجا للIVM يرجع ذلك إلى حقيقة أن الغدد يمكن الوصول إليها بسهولة عن طريق إجراء عملية جراحية بسيطة، يمكن تخريجها دون المساس بهم علم وظائف الأعضاء، واستقرت للحد من الحركة الفنية بسبب ضربات القلب والتنفس. بالإضافة إلى ذلك، SGS يمكن التلاعب بها وراثيا عن طريق حقن انتقائي ناقلات إما فيروسية أو غير الفيروسية مقرها من خلال القناة اللعابية 8،9. أخيرا، اس جي اس هي الغدد خارجية الإفراز تتألف من epith الاستقطابخلايا الليل، والتي تشكل عنيبات والقنوات، وخلايا عضلية ظهارية، ويبلغ عدد سكانها معقدة من الخلايا اللحمية. لهذا السبب، فهي نموذجا ممتازا لدراسة إيماس، الإلتقام، والتسليم الجينات، والهيكل الخلوي الأكتين، على النحو المبين في دراساتنا الأخيرة 10، وتتيح الفرصة لدراسة جوانب بيولوجيا الخلايا مثل الخلايا القطبية، انقسام الخلايا، خلية تقاطعات الخلية، والقنوات الأيونية.
في هذه الورقة نحن تصف بالتفصيل بروتوكول التصوير لتحقيق قرار التحت خلوية في ظهارة من SGS على فأرة الحاسوب حية. على وجه التحديد، وتبين لنا كيفية صورة حبيبات إفرازية في خلايا عنيبية من SGS خلال إيماس المنظمة. كما هو موضح سابقا، على التحفيز مع منبهات مستقبلات بيتا الأدرينالية، وحبيبات إفرازية تلتحم مع غشاء البلازما قمية وتنهار تدريجيا، والإفراج عن محتوياتها في نفيق عنيبية 6. هدفنا هو توفير الأدوات الأساسية للمحققين مع متجربة inimal في العمليات الجراحية والتعامل مع الحيوانات، حتى يتمكنوا من أداء بنجاح IVM في قرار التحت خلوية. منذ الجزء الأكثر تحديا في IVM هو التحضير للحيوان، وهنا نركز على وصف الإجراءات الجراحية الأساسية التي تستخدم لكشف ولشل حركة SGS دون المساس ظيفتها. أما بالنسبة للإجراءات لتسمية البنى التحت خلوية، عدة استراتيجيات، مثل تسليم النظامية من تحقيقات الفلورسنت، واستخدام الحيوانات المعدلة وراثيا، أو مزيج من الاثنين معا، وقد وصفت في مكان آخر 7،11.
Protocol
Representative Results
Discussion
حتى الآن تم تصوير معظمها في البنى التحت خلوية في المختبر (أي مزارع الخلايا) أو في فيفو السابقين (أي الجهاز الثقافات، وشرائح الأنسجة، والاستعدادات عنيبية) نظم النموذج الذي غالبا ما لا ألخص خصائص الأنسجة الحية سليمة 6. في هذا الصدد، والنهج المقدمة هنا يم?…
Acknowledgements
وأيد هذا البحث من قبل برنامج بحوث جماعية من المعاهد الوطنية للصحة، والمعهد الوطني للأبحاث الأسنان والجمجمة.
Materials
| Reagent | |||
| Isoflourane (Forane) | Baxter | 101936-40 | Handle under chemical hood |
| Ketamine (ketaved) | Fort Dodge Animal Health | 57457-034-10 | Stock solution 100 mg/ml |
| Xylazine (Anased) | Akorn, Decatur | 61311-481-10 | Stock solution 100 mg/ml |
| Neomycin/Polymyxin B | Bausch and Lomb | 24208-785-55 | Use to lubricate the eye of the mouse |
| Carbomer-940 | Ashalnd, Inc. | 4607-1 | |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279 | Add drop wise to prevent the solution to solidify |
| Isoproternol | Sigma-Aldrich | 16504 | Prepare fresh solutions in saline when needed. Stocks can be stored at -20 °C |
| Instrument | |||
| Isoflurane V 1.9 (Vaporizer) | Braintree Scientific | 190AF | |
| Portable Downdraft table equipped with HEPA filter | Hazard Technology | PDDT | |
| Heat lamp, Model HL1 | Braintree Scientific | HL-1 US | |
| MicroTherma 2T Thermometer | Braintree Scientific | TW2 | |
| Operating Scissors (11.5 cm straight | World Precision Instruments | 5003708-12 | |
| #7 curved tip tweezers | World Precision Instruments | 14187 | |
| Microscissors | World Precision Instruments | 503365 | |
| Black Braided Silk suture #4.0 | George & Tiemann & Co | 160-1219-4 | |
| Gauze sponges 2″ x 2″ | Tyco Healthcare | 9022 | |
| Lens cleaning tissue | Olympus | CL-TISSUE (M97) AX6476 |
References
- Lippincott-Schwartz, J. Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*). Annu Rev Biochem. 80, 327-332 (2011).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).
- Dunn, K. W., et al. Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 283, C905-C916 (2002).
- Masedunskas, A., Porat-Shliom, N., Weigert, R. Regulated exocytosis: novel insights from intravital microscopy. Traffic. 13, 627-634 (2012).
- Masedunskas, A., et al. Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13552-13557 (2011).
- Masedunskas, A., Weigert, R. Intravital two-photon microscopy for studying the uptake and trafficking of fluorescently conjugated molecules in live rodents. Traffic. 9, 1801-1810 (2008).
- Sramkova, M., Masedunskas, A., Parente, L., Molinolo, A., Weigert, R. Expression of plasmid DNA in the salivary gland epithelium: novel approaches to study dynamic cellular processes in live animals. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C1347-C1357 (2009).
- Sramkova, M., Najman, S., et al. . Current Frontiers and Perspectives in Cell Biology. , (2012).
- Masedunskas, A., et al. Everything you need to know about intravital microscopy: A practical guide on imaging intracellular structures in live animals. Bioarchitecture. 2, (2012).
- Masedunskas, A., Sramkova, M., Parente, L., Weigert, R. Intravital microscopy to image membrane trafficking in live rats. Methods Mol. Biol. 931, 153-167 (2013).
- Babbey, C. M., Ryan, J. C., Gill, E. M., Ghabril, M. S., Burch, C. R., Paulman, A., Dunn, K. W. Quantitative intravital microscopy of hepatic transport. Intravital. 1, 44-53 (2012).
- Rothstein, E. C., Nauman, M., Chesnick, S., Balaban, R. S. Multi-photon excitation microscopy in intact animals. J. Microsc. 222, 58-64 (2006).
- Klinger, A., Orzekowsky-Schroeder, R., von Smolinski, D., Blessenohl, M., Schueth, A., Koop, N., Huettmann, G., Gebert, A. Complex morphology and functional dynamics of vital murine intestinal mucosa revealed by autofluorescence 2-photon microscopy. Histochem. Cell Biol. 137, 269-278 (2012).
- Peter, B., Van Waarde, M. A., Vissink, A., s-Gravenmade, E. J., Konings, A. W. Degranulation of rat salivary glands following treatment with receptor-selective agonists. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 22, 330-336 (1995).
