Intravitalmikroskopie zur Imaging subzellulärer Strukturen in lebenden Mäusen Ausdruck Fluoreszierende Proteine

Summary

Intravitalmikroskopie ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das die Abbildung verschiedener biologischer Prozesse in lebenden Tieren ermöglicht. In diesem Artikel stellen wir eine detaillierte Methode zur Abbildung der Dynamik der subzellulären Strukturen, wie den sekretorischen Granula, in den Speicheldrüsen von lebenden Mäusen.

Abstract

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Bild subzelluläre Strukturen in lebenden Nager, die auf der Verwendung von konfokalen Intravitalmikroskopie beruht. Als Modell Organ, verwenden wir die Speicheldrüsen von lebenden Mäusen, da sie mehrere Vorteile. Erstens kann sie leicht freigelegt werden, um den Zugriff auf die Optik zu ermöglichen, und stabilisiert ist, um die Reduzierung der Bewegungsartefakte aufgrund von Herzschlag und Atmung zu erleichtern. Dies erleichtert Bildgebung und Tracking kleine subzellulärer Strukturen. Zweitens, die meisten Zellpopulationen der Speicheldrüsen von der Oberfläche des Organs zu erreichen. Dies ermöglicht die Verwendung der konfokalen Mikroskopie, die eine höhere räumliche Auflösung als andere Techniken, die für die in vivo-Bildgebung verwendet wurden, wie beispielsweise Zwei-Photonen-Mikroskopie. Schließlich kann Speicheldrüsen leicht pharmakologisch und genetisch manipuliert werden, so dass ein robustes System zur biologischen Prozesse auf molekularer Ebene zu untersuchen.

In dieser Studie konzentrieren wir uns auf ein Protokoll, das die Kinetik der Exozytose von sekretorischen Granula in Azinuszellen und die Dynamik der apikalen Plasmamembran, wo die sekretorischen Granula fusionieren bei Stimulierung der ß-adrenergen Rezeptoren folgen. Insbesondere verwendeten wir eine transgene Maus, die co-exprimiert GFP cytosolische und membranZielPeptid mit dem fluoreszierenden Protein Tandem-Tomato fusioniert. Allerdings können die Verfahren, die wir zur Stabilisierung und Bild die Speicheldrüsen zu anderen Mausmodellen erweitert und an andere Ansätze zur in-vivo-Zellbestandteile zu kennzeichnen, so dass die Visualisierung verschiedener subzellulärer Strukturen, wie Endosomen, Lysosomen, Mitochondrien gekoppelt werden, und das Aktin-Zytoskelett.

Introduction

In den vergangenen zwei Jahrzehnten die Einführung von Live-Mikroskopie und die Verwendung von fluoreszierenden Proteinen haben große Durchbrüche auf jedem erdenklichen zellulären Prozess geführt, damit unser Verständnis der Zellbiologie ^ein. Dieses Feld enorm von der Verwendung von Säugetierzellkulturen, die extrem leistungsfähigen Modellsysteme, besonders, wenn es um experimentelle Manipulationen kommt profitiert hat. Allerdings stehen sie nicht oft bieten keine wahre Darstellung der Biologie der komplexen mehrzelligen Organismen ^2. Dieses Problem hat damit begonnen, von der Entwicklung der Intravitalmikroskopie (IVM) angesprochen werden, die die Tür zur Untersuchung biologischer Schlüsselfragen in Bereichen wie der Neurobiologie, Immunologie und Tumorbiologie ³ geöffnet wurde. Bisher haben die meisten der Studien, die auf IVM wurden auf der Ebene von Geweben und einzelnen Zellen durchgeführt wurde, ohne Angaben über die Dynamik der subzellulären Kompartimenten. Vor kurzem hat unser Labor und anderes haben IVM Techniken in der Lage, Bild subzellulärer Strukturen in lebenden Nagern ^{4-7, 13-15} und so pharmakologischen und genetischen Manipulationen in vivo entwickelt. Dieser Ansatz wurde von uns verwendet worden, um Membrantransport in vivo zu untersuchen, und insbesondere Endozytose und Exozytose reguliert ^6,7.

Unsere experimentellen Modellsystem wird auf die Entlarvung, die Stabilisierung und die Abbildung der Unterkieferspeichelspeicheldrüsen (DMS) der Nager betäubt basiert. Die Wahl der SGs als Modell für Orgel IVM aufgrund der Tatsache, dass die Drüsen, indem eine kleine Chirurgie leicht zugänglich sind, kann ohne ihre Physiologie externalisiert werden und stabilisiert, um die Bewegungsartefakte durch Atmung und Herzschlag reduzieren. Außerdem SGs selektiv entweder genetisch durch die Injektion von viralen oder nicht-viralen Vektoren auf der Basis durch den Speichelgang ^8,9 manipuliert werden. Schließlich SGs sind exokrinen Drüsen des polarisierten epith zusammenElial Zellen, die den Acini und die Kanäle, Myoepithelzellen, und eine komplexe Population von Stromazellen zu bilden. Aus diesem Grund sind sie ein hervorragendes Modell zur Exozytose, Endozytose, Gentransfer und Aktin-Zytoskelett zu studieren, wie in unserem aktuellen Studien ¹⁰ markiert ist, und bieten die Möglichkeit, Aspekte der Zellbiologie wie Zellpolarität, Zellteilung, Zell studieren Zellverbindungen und Ionenkanälen.

In diesem Beitrag beschreiben wir im Detail ein Abbildungs ​​Protokoll für die Erreichung subzellulärer Auflösung im Epithel der SGs einer Live-Maus. Insbesondere zeigen wir, wie man die Bild sekretorischen Granula in den Azinuszellen der SGs im regulierten Exozytose. Wie bereits dargestellt, nach Stimulation mit Agonisten des beta-adrenergen Rezeptor, verschmelzen die sekretorischen Granula mit der apikalen Plasmamembran und nach und nach zusammenbrechen, die Freigabe ihrer Inhalte in die Kanälchen acinar ^6. Unser Ziel ist es, die grundlegenden Werkzeuge, um die Ermittler mit m bieteninimal Erfahrung in der chirurgischen Verfahren und die Behandlung der Tiere, so dass sie erfolgreich bei einem subzellulärer Auflösung durchführen IVM. Da der schwierigste Teil in IVM ist die Vorbereitung des Tieres, hier konzentrieren wir uns auf die Beschreibung der grundlegenden chirurgischen Verfahren, die verwendet werden, um zu entlarven und zu immobilisieren die SGs, ohne ihre Funktion zu beeinträchtigen. Wie bei den Verfahren zur subzellulären Strukturen, verschiedene Strategien, wie systemische Abgabe von Fluoreszenzsonden, die Verwendung von transgenen Tieren, oder eine Kombination von beiden zu markieren, wurden an anderer Stelle beschrieben worden ist ^7,11.

Protocol

Teil 1: Mikroskop und Vorbereitung der Imaging-Setup Jede invertiert konfokalen Mikroskop sollte für IVM sein. In dieser Studie eine Olympus IX81 inverses Mikroskop, mit einer FluoView-1000 konfokaler Laser-Scanning-Einheit ausgestattet war. Um die bestmögliche Auflösung zu erreichen, ist der Einsatz von Hoch NA Ziele, wie zB die Wasser-Immersions UPLSAPO 60x/1.20 NA, und der Öl-Immersion-Plan-Apo 60x/1.42 NA empfohlen. Ölimmersionsobjektive haben höhere Sammelwirkungsgrade und obwohl sie die Verwendung…

Representative Results

In der GFP / mTomato Maus, die Acini erscheinen als deutlich verschieden Strukturen, die GFP cytosolische und membran gezielte Tandem-Tomato-Peptid (Abbildung 2, gestrichelte Linie) zum Ausdruck bringen. In einzelnen Acini werden Azinuszellen durch die Tandem-Tomaten-Peptid abgegrenzt. GFP ist auch in den Kernen, die eindeutig in den Azinuszellen sichtbar (Fig. 2, Pfeil) nachgewiesen. Cytosolic GFP wird aus den sekretorischen Granula, die als dunkle kreisförmige Vesikel von etwa 1 bis …

Discussion

Bisher subzellulärer Strukturen sind meist in in vitro (dh Zellkulturen) oder im ex vivo (dh Organkulturen, Gewebeschnitt, acinar Zubereitungen) Modellsysteme, die oft nicht die Eigenschaften von intakten lebenden Gewebe ⁶ rekapitulieren abgebildet worden. In dieser Hinsicht ist die hier vorgestellte Ansatz stellt einen wichtigen Durchbruch, da es ermöglicht die Abbildung der Dynamik einer bestimmten Membrantransportschritt (dh geregelt Exozytose) in lebenden Mäusen.

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Materials

			Reagent
Isoflourane (Forane)	Baxter	101936-40	Handle under chemical hood
Ketamine (ketaved)	Fort Dodge Animal Health	57457-034-10	Stock solution 100 mg/ml
Xylazine (Anased)	Akorn, Decatur	61311-481-10	Stock solution 100 mg/ml
Neomycin/Polymyxin B	Bausch and Lomb	24208-785-55	Use to lubricate the eye of the mouse
Carbomer-940	Ashalnd, Inc.	4607-1
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
Triethanolamine	Sigma-Aldrich	90279	Add drop wise to prevent the solution to solidify
Isoproternol	Sigma-Aldrich	16504	Prepare fresh solutions in saline when needed. Stocks can be stored at -20 °C
			Instrument
Isoflurane V 1.9 (Vaporizer)	Braintree Scientific	190AF
Portable Downdraft table equipped with HEPA filter	Hazard Technology	PDDT
Heat lamp, Model HL1	Braintree Scientific	HL-1 US
MicroTherma 2T Thermometer	Braintree Scientific	TW2
Operating Scissors (11.5 cm straight	World Precision Instruments	5003708-12
#7 curved tip tweezers	World Precision Instruments	14187
Microscissors	World Precision Instruments	503365
Black Braided Silk suture #4.0	George & Tiemann & Co	160-1219-4
Gauze sponges 2″ x 2″	Tyco Healthcare	9022
Lens cleaning tissue	Olympus	CL-TISSUE (M97) AX6476