Intravitale Microscopy for Imaging Subcellulaire Structuren in Levende muizen die fluorescerende eiwitten
Summary
Opklaren is een krachtige tool waarmee beeldvorming verschillende biologische processen in levende dieren. In dit artikel presenteren we een gedetailleerde werkwijze voor het afbeelden van de dynamiek van subcellulaire structuren, zoals de secretoire granules in de speekselklieren van levende muizen.
Abstract
Hier beschrijven we een werkwijze voor het subcellulaire structuren in levende knaagdieren die is gebaseerd op het gebruik van confocale intravitale microscopie. Als model orgaan, gebruiken we de speekselklieren van levende muizen aangezien ze verschillende voordelen. Ten eerste kunnen ze gemakkelijk worden blootgesteld toegang tot de optiek mogelijk en gestabiliseerd vermindering van de bewegingsartefacten als gevolg van hartslag en ademhaling bevorderen. Dit vergemakkelijkt aanzienlijk beeldvorming en het bijhouden van kleine subcellulaire structuren. Ten tweede, de meeste van de celpopulaties van de speekselklieren zijn vanaf het oppervlak van het orgaan. Hierdoor is het gebruik van confocale microscopie met een hogere ruimtelijke resolutie dan andere technieken die zijn gebruikt voor in vivo beeldvorming, zoals twee-foton microscopie. Tenslotte speekselklieren kan gemakkelijk farmacologisch en genetisch gemanipuleerde, zodat een robuust systeem te onderzoeken biologische processen op moleculair niveau.
In deze studie behandelen we een protocol ontwikkeld om de kinetiek van de exocytose van secretoire korrels in acinaire cellen en de dynamiek van het apicale plasmamembraan waar de secretoire granules smelten bij stimulatie van de beta-adrenerge receptoren volgen. Specifiek, gebruikten we een transgene muis die co-expressie cytosolische GFP en een membraan gerichte gefuseerd met het fluorescerende proteïne tandem-tomaat. Echter, de procedures die we gebruikten te stabiliseren en beeld de speekselklieren worden uitgebreid tot andere muismodellen en gekoppeld aan andere benaderingen van in vivo cellulaire componenten worden, waardoor de visualisatie van verschillende subcellulaire structuren zoals endosomen, lysosomen, mitochondria, en het actine cytoskelet.
Introduction
In de afgelopen twee decennia de komst van levende microscopie en het gebruik van fluorescente proteïnen geleid tot grote doorbraken op elke denkbare cellulair proces, waardoor onze kennis van celbiologie 1. Dit veld heeft enorm geprofiteerd van het gebruik van zoogdierlijke celkweken die zeer krachtig modelsystemen, vooral als het gaat om experimentele manipulaties. Echter, ze niet vaak een getrouw beeld geeft van de biologie van complexe meercellige organismen 2. Dit probleem is begonnen met de ontwikkeling van opklaren (IVM) worden aangepakt dat de deur naar het onderzoeken van de belangrijkste biologische vragen op gebieden als neurobiologie, immunologie en tumorbiologie 3 heeft geopend. Tot dusver meeste studies op basis van IVM uitgevoerd op het niveau van individuele cellen en weefsels, zonder enige informatie over de dynamiek van subcellulaire compartimenten. Onlangs heeft ons laboratorium en anderes hebben IVM technieken kunnen beeldvorming subcellulaire structuren in levende knaagdieren 4-7, 13-15 en waardoor farmacologische en genetische manipulaties in vivo ontwikkeld. Deze aanpak is door ons gebruikt om membraan mensenhandel te bestuderen in vivo, en meer specifiek endocytose en gereguleerd exocytose 6,7.
Onze experimentele model is gebaseerd op het blootstellen stabiliseren en weergave de submandibulaire speekselklier (SG) van verdoofd knaagdieren. De keuze van de SG als model orgaan voor IVM komt door het feit dat de klieren gemakkelijk toegankelijk door het uitvoeren van een kleine ingreep, kan buiten gebracht zonder dat hun fysiologie en gestabiliseerd de bewegingsartefacten als gevolg van hartslag en ademhaling verminderen. Bovendien SG selectief worden genetisch gemanipuleerd door injectie of virale of niet-virale gebaseerde vectoren via speeksel kanaal 8,9. Tot slot, SGS zijn exocriene klieren bestaat uit gepolariseerde epithElial cellen, die de acini en leidingen, myo cellen, en een complexe populatie van stromale cellen vormen. Om deze reden, zijn ze een uitstekend model om exocytose, endocytose, gentherapie, en actine cytoskelet te bestuderen, zoals blijkt uit onze recente studies 10, en bieden de mogelijkheid om aspecten van celbiologie zoals cel polariteit, celdeling, cel-studie cel contacten, en ionkanalen.
In dit artikel beschrijven we in detail een imaging protocol voor het bereiken van subcellulaire resolutie in het epitheel van de SG's van een live-muis. Specifiek, laten we zien hoe het imago van de secretoire korrels in de acinuscellen van de SG's tijdens gereguleerde exocytose. Zoals eerder aangetoond, na stimulatie met agonisten van beta-adrenerge receptoren, de secretoire granules fuseren met de apicale plasmamembraan en geleidelijk instorten vrijgeven van de inhoud in de acinaire canaliculi 6. Ons doel is om de fundamentele hulpmiddelen verstrekken aan onderzoekers met minimal ervaring in chirurgische procedures en dierlijke behandeling, zodat ze met succes kunnen IVM presteren op een subcellulaire resolutie. Aangezien de meest uitdagende gedeelte van IVM is de bereiding van het dier, hier richten we ons op de beschrijving van de fundamentele chirurgische procedures die worden gebruikt om bloot te immobiliseren en de SG zonder hun functie te compromitteren. Wat betreft de procedures voor subcellulaire structuren, verschillende strategieën, zoals systemische afgifte van fluorescente probes, het gebruik van transgene dieren, of een combinatie van beide label, 7,11 elders beschreven.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tot dusver subcellulaire structuren zijn afgebeeld meestal in in vitro (dwz celculturen) of ex vivo (dwz orgel-culturen, weefsel plakjes, acinar preparaten) modelsystemen die vaak niet recapituleren de kenmerken van intacte levende weefsels 6. In dit opzicht is de hier gepresenteerde benadering een belangrijke doorbraak omdat zo beeldvorming van de dynamiek van een specifieke membraantransport stap (gereglementeerde exocytose) in levende muizen.
Dit prot…
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gesteund door de Intramurale Research Program van de NIH, National Institute of Dental en Craniofacial Research.
Materials
| Reagent | |||
| Isoflourane (Forane) | Baxter | 101936-40 | Handle under chemical hood |
| Ketamine (ketaved) | Fort Dodge Animal Health | 57457-034-10 | Stock solution 100 mg/ml |
| Xylazine (Anased) | Akorn, Decatur | 61311-481-10 | Stock solution 100 mg/ml |
| Neomycin/Polymyxin B | Bausch and Lomb | 24208-785-55 | Use to lubricate the eye of the mouse |
| Carbomer-940 | Ashalnd, Inc. | 4607-1 | |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279 | Add drop wise to prevent the solution to solidify |
| Isoproternol | Sigma-Aldrich | 16504 | Prepare fresh solutions in saline when needed. Stocks can be stored at -20 °C |
| Instrument | |||
| Isoflurane V 1.9 (Vaporizer) | Braintree Scientific | 190AF | |
| Portable Downdraft table equipped with HEPA filter | Hazard Technology | PDDT | |
| Heat lamp, Model HL1 | Braintree Scientific | HL-1 US | |
| MicroTherma 2T Thermometer | Braintree Scientific | TW2 | |
| Operating Scissors (11.5 cm straight | World Precision Instruments | 5003708-12 | |
| #7 curved tip tweezers | World Precision Instruments | 14187 | |
| Microscissors | World Precision Instruments | 503365 | |
| Black Braided Silk suture #4.0 | George & Tiemann & Co | 160-1219-4 | |
| Gauze sponges 2″ x 2″ | Tyco Healthcare | 9022 | |
| Lens cleaning tissue | Olympus | CL-TISSUE (M97) AX6476 |
References
- Lippincott-Schwartz, J. Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*). Annu Rev Biochem. 80, 327-332 (2011).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).
- Dunn, K. W., et al. Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 283, C905-C916 (2002).
- Masedunskas, A., Porat-Shliom, N., Weigert, R. Regulated exocytosis: novel insights from intravital microscopy. Traffic. 13, 627-634 (2012).
- Masedunskas, A., et al. Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13552-13557 (2011).
- Masedunskas, A., Weigert, R. Intravital two-photon microscopy for studying the uptake and trafficking of fluorescently conjugated molecules in live rodents. Traffic. 9, 1801-1810 (2008).
- Sramkova, M., Masedunskas, A., Parente, L., Molinolo, A., Weigert, R. Expression of plasmid DNA in the salivary gland epithelium: novel approaches to study dynamic cellular processes in live animals. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C1347-C1357 (2009).
- Sramkova, M., Najman, S., et al. . Current Frontiers and Perspectives in Cell Biology. , (2012).
- Masedunskas, A., et al. Everything you need to know about intravital microscopy: A practical guide on imaging intracellular structures in live animals. Bioarchitecture. 2, (2012).
- Masedunskas, A., Sramkova, M., Parente, L., Weigert, R. Intravital microscopy to image membrane trafficking in live rats. Methods Mol. Biol. 931, 153-167 (2013).
- Babbey, C. M., Ryan, J. C., Gill, E. M., Ghabril, M. S., Burch, C. R., Paulman, A., Dunn, K. W. Quantitative intravital microscopy of hepatic transport. Intravital. 1, 44-53 (2012).
- Rothstein, E. C., Nauman, M., Chesnick, S., Balaban, R. S. Multi-photon excitation microscopy in intact animals. J. Microsc. 222, 58-64 (2006).
- Klinger, A., Orzekowsky-Schroeder, R., von Smolinski, D., Blessenohl, M., Schueth, A., Koop, N., Huettmann, G., Gebert, A. Complex morphology and functional dynamics of vital murine intestinal mucosa revealed by autofluorescence 2-photon microscopy. Histochem. Cell Biol. 137, 269-278 (2012).
- Peter, B., Van Waarde, M. A., Vissink, A., s-Gravenmade, E. J., Konings, A. W. Degranulation of rat salivary glands following treatment with receptor-selective agonists. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 22, 330-336 (1995).
