Microscopie intravitale pour l'imagerie Subcellular ouvrages chez des souris vivantes exprimant des protéines fluorescentes
Summary
Microscopie intravitale est un outil puissant qui permet l'imagerie de divers processus biologiques chez les animaux vivants. Dans cet article, on présente un procédé détaillé pour l'imagerie de la dynamique des structures sous-cellulaires, telles que les granules de sécrétion, dans les glandes salivaires des souris vivantes.
Abstract
Nous décrivons ici un procédé pour l'image des structures sous-cellulaires chez les rongeurs vivants qui est basé sur l'utilisation de la microscopie intravitale confocale. En tant qu'organe de modèle, nous utilisons les glandes salivaires des souris vivantes, car ils offrent plusieurs avantages. Tout d'abord, ils peuvent être facilement exposées à permettre l'accès à l'optique, et stabilisés pour faciliter la réduction des artefacts de mouvement à cause de battement de coeur et de la respiration. Ceci facilite considérablement l'imagerie et de suivi de petites structures sous-cellulaires. En second lieu, la plupart des populations de cellules des glandes salivaires sont accessibles à partir de la surface de l'organe. Ceci permet l'utilisation de la microscopie confocale qui a une résolution spatiale plus élevée que d'autres techniques qui ont été utilisées pour l'imagerie in vivo, tels que la microscopie à deux photons. Enfin, les glandes salivaires peuvent être facilement manipulées génétiquement et pharmacologiquement, fournissant ainsi un système robuste d'étudier les processus biologiques au niveau moléculaire.
Dans cette étude, nous nous intéressons à un protocole conçu pour suivre la cinétique de l'exocytose des granules de sécrétion dans les cellules acineuses et la dynamique de la membrane plasmique apicale où les granules sécrétoires fusionnent lors de la stimulation des récepteurs bêta-adrénergiques. Plus précisément, nous avons utilisé une souris transgénique qui co-exprime cytosolique GFP et un peptide de la membrane cible fusionnée à la protéine fluorescente tandem tomate. Cependant, les procédés que nous avons utilisés pour stabiliser et de l'image des glandes salivaires peuvent être étendus à d'autres modèles de souris et couplé à d'autres approches pour étiqueter les composants cellulaires in vivo, ce qui permet la visualisation des différentes structures sous-cellulaires, tels que les endosomes, les lysosomes, les mitochondries, et le cytosquelette d'actine.
Introduction
Dans les deux dernières décennies, l'avènement de la microscopie en direct et l'utilisation de protéines fluorescentes ont conduit à des avancées majeures sur chaque processus cellulaire imaginables, faisant ainsi progresser notre compréhension de la biologie des cellules 1. Ce champ a considérablement bénéficié de l'utilisation de cultures de cellules de mammifères qui sont des systèmes modèles très puissants, en particulier quand il s'agit de manipulations expérimentales. Cependant, ils ne fournissent pas souvent une représentation fidèle de la biologie des organismes multicellulaires complexes 2. Cette question a commencé à être abordées par le développement de la microscopie intravitale (IVM), qui a ouvert la porte à l'analyse des questions biologiques clés dans des domaines tels que la neurobiologie, l'immunologie et de la biologie de la tumeur 3. Jusqu'ici, la plupart des études fondées sur l'IVM ont été réalisées au niveau des tissus et des cellules individuelles, sans fournir aucune information sur la dynamique des compartiments sous-cellulaires. Récemment, notre laboratoire et d'autress ont développé des techniques capables d'IVM imagerie structures sous-cellulaires chez les rongeurs vivants 4-7, 13-15 et permettant des manipulations pharmacologiques et génétiques in vivo. Cette approche a été utilisée par nous pour étudier le trafic membranaire in vivo, et plus particulièrement l'endocytose et exocytose régulée 6,7.
Notre système de modèle expérimental est basé sur l'exposition, la stabilisation et l'imagerie des glandes salivaires sous-maxillaires (SG) de rongeurs anesthésiés. Le choix de la SG en tant qu'organe de modèle pour IVM est dû au fait que les glandes sont facilement accessibles en effectuant une chirurgie mineure, peut être externalisé sans compromettre leur physiologie, et stabilisé pour réduire les artefacts de mouvement en raison de battement de coeur et la respiration. En outre, SG peut être manipulée génétiquement de façon sélective soit par l'injection de vecteurs viraux ou non viraux basés à travers le canal salivaire 8,9. Enfin, SG sont des glandes exocrines composées de epith polariséeElial cellules qui forment les acini et canaux, les cellules myoépithéliales, et une population complexe de cellules stromales. Pour cette raison, ils sont un excellent modèle pour étudier l'exocytose, l'endocytose, la livraison de gènes, et le cytosquelette d'actine, comme l'a souligné dans nos études récentes 10, et offrir la possibilité d'étudier les aspects de la biologie cellulaire, tels que la polarité cellulaire, la division cellulaire, la cellule jonctions cellulaires, et des canaux ioniques.
Dans cet article, nous décrivons en détail un protocole d'imagerie pour la réalisation de la résolution subcellulaire dans l'épithélium des SG d'une souris vivante. Plus précisément, nous montrons comment l'imagerie des granules de sécrétion dans les cellules acineuses des SG durant l'exocytose régulée. Comme montré précédemment, lors de la stimulation par des agonistes du récepteur bêta-adrénergique, les granules de sécrétion fusionnent avec la membrane plasmique apicale et s'affaissent peu à peu, libérant leur contenu dans les cellules acineuses canalicules 6. Notre objectif est de fournir les outils de base pour enquêteurs mexpérience inimal dans les procédures chirurgicales et la manipulation des animaux, afin qu'ils puissent effectuer avec succès IVM à une résolution subcellulaire. Depuis la partie la plus difficile dans l'IVM est la préparation de l'animal, ici nous nous concentrons sur la description des procédures chirurgicales de base qui sont utilisées pour exposer et immobiliser les SG sans compromettre leur fonction. En ce qui concerne les procédures pour étiqueter les structures sous-cellulaires, plusieurs stratégies, telles que l'administration systémique de sondes fluorescentes, l'utilisation d'animaux transgéniques, ou une combinaison des deux, ont été décrits ailleurs 7,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Jusqu'à présent, les structures sous-cellulaires ont été imagées essentiellement in vitro (c'est à dire des cultures de cellules) ou ex vivo (c.-à-orga-cultures, des tranches de tissus, préparations acineuses) systèmes modèles qui souvent ne récapitulent les caractéristiques des tissus vivants intacts 6. À cet égard, l'approche présentée ici représente une percée majeure car elle permet l'imagerie de la dynamique d'une étape de trafic membranaire spéci…
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par le Programme de recherche intra-muros des NIH, l'Institut national de recherche dentaire et craniofaciale.
Materials
| Reagent | |||
| Isoflourane (Forane) | Baxter | 101936-40 | Handle under chemical hood |
| Ketamine (ketaved) | Fort Dodge Animal Health | 57457-034-10 | Stock solution 100 mg/ml |
| Xylazine (Anased) | Akorn, Decatur | 61311-481-10 | Stock solution 100 mg/ml |
| Neomycin/Polymyxin B | Bausch and Lomb | 24208-785-55 | Use to lubricate the eye of the mouse |
| Carbomer-940 | Ashalnd, Inc. | 4607-1 | |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279 | Add drop wise to prevent the solution to solidify |
| Isoproternol | Sigma-Aldrich | 16504 | Prepare fresh solutions in saline when needed. Stocks can be stored at -20 °C |
| Instrument | |||
| Isoflurane V 1.9 (Vaporizer) | Braintree Scientific | 190AF | |
| Portable Downdraft table equipped with HEPA filter | Hazard Technology | PDDT | |
| Heat lamp, Model HL1 | Braintree Scientific | HL-1 US | |
| MicroTherma 2T Thermometer | Braintree Scientific | TW2 | |
| Operating Scissors (11.5 cm straight | World Precision Instruments | 5003708-12 | |
| #7 curved tip tweezers | World Precision Instruments | 14187 | |
| Microscissors | World Precision Instruments | 503365 | |
| Black Braided Silk suture #4.0 | George & Tiemann & Co | 160-1219-4 | |
| Gauze sponges 2″ x 2″ | Tyco Healthcare | 9022 | |
| Lens cleaning tissue | Olympus | CL-TISSUE (M97) AX6476 |
References
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