Messung des Gesamtcalciums in Neuronen, die durch Elektronensonden-Röntgenmikroanalyse

Summary

Dieses Papier beschreibt die Anwendung von cryoanalytical Elektronenmikroskopie auf die quantitative Messung der Gesamtkalziumgehalt und die Verteilung auf subzellulärer Auflösung in physiologisch definierte biologische Proben.

Abstract

In diesem Artikel werden die Werkzeuge, Techniken und Instrumente für quantitative Messungen der intrazellulären Elementgehalt falls unter Verwendung der Technik, die als Elektronenstrahl-Mikroanalyse (ESMA) bekannt sind, beschrieben. Intramitochondrialen Kalzium ist ein besonderer Schwerpunkt wegen der kritischen Rolle, dass die mitochondriale Calciumüberladung spielt bei neurodegenerativen Erkrankungen. Die Methode basiert auf der Analyse der Röntgenstrahlen erzeugt in einem Elektronenmikroskop (EM) durch Wechselwirkung eines Elektronenstrahls mit der Probe berechnet. Um die native Verteilung der diffusionsfähigen Elemente in der Elektronenmikroskopie Proben zu erhalten, erfordert ESMA "Kryofixation" von Gewebe, gefolgt von der Herstellung von ultradünnen Gefrierschnitten. Schockgefrieren von kultivierten Zellen oder organotypischen Kulturen wird durch Eint Einfrieren in flüssigem Ethan oder durch Einfrieren Slam gegen einen kalten Metallblock bzw. durchgeführt. Cryoschnitte nominell 80 nm dick sind trocken mit einem Diamantmesser bei ca. geschnitten. -16076, C, auf Kohlenstoff / PIOLOFORM beschichteten Kupfergitter montiert und cryotransferred in eine Kryo-EM mit Hilfe eines speziellen cryospecimen Halter. Nach der visuellen Mapping-Umfrage und die Lage bei ≤ 160 ° C und niedriger Elektronendosis, sind tiefgefrorenen Gefrierschnitten gefriergetrockneten bei -100 ° C ~ 30 min. Organell Stufenbilder von getrockneten Kryoabschnitte aufgezeichnet sind, auch bei niedrigen Dosis mittels einer Slow-Scan-CCD-Kamera und subzellulären Regionen von Interesse für die Analyse ausgewählt. Röntgenstrahlen von einem stationären, konzentriert, mit hoher Intensität Elektronensonde von ROIs emittiert werden, von einer energiedispersiven Röntgenanalyse (EDX)-Spektrometer, um die zugehörige Elektronik verarbeitet und als Röntgenspektrum präsentiert gesammelt, das heißt, ein Grundstück von Röntgenintensität vs Energie. Zusätzliche Software erleichtert: 1) Identifizierung von elementaren Komponenten durch ihre "charakteristisch" Spitzen Energien und Fingerabdruck, und 2) die quantitative Analyse durch Extraktion der Peakflächen / Hintergrund. Das Papier schließt mit zwei Beispiele, die veranschaulichen typischeEPMA-Anwendungen, in denen eine mitochondriale Calciumanalyse vorgesehen kritischen Einblick in Mechanismen der exzitotoxischen Schädigung und eine andere, die die Grundlage der Ischämie Beständigkeit zeigte.

Introduction

Calciumionen sind wohl die wichtigsten und vielseitigsten Zellsignalisierungseinheit in der Biologie, spielen eine wesentliche Rolle in der normalen Prozesse so vielfältig wie die synaptische Transmission und Genexpression. Auf der anderen Seite, ist Calcium in Zelltod ebenso wichtig. Insbesondere ist ein Schlüsselfaktor in der neuronalen Verletzungen in der Schlaganfall-Kalzium Deregulierung, Parkinson, Alzheimer und anderen neurodegenerativen Erkrankungen ^3,5. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, um quantitativ zu verstehen, wie Calcium in den Zellen verteilt und wie diese Veränderungen nach physiologischen oder pathophysiologischen Stimuli. Frei in Lösung oder an ein Substrat gebunden - - und das zelluläre Calciumkonzentrationen über mehrere Größenordnungen als Folge der Stimulation verändern Dieses Ziel wird durch die Tatsache, dass Kalzium wird dynamisch zwischen zwei physikalische Zustände verteilt kompliziert.

Zwar gibt es mehrere Methoden für die erweiterte Analyse fr verfügbaree intrazellulären Calcium ist die Bestimmung der Gesamtcalciumkonzentrationen in definierten intrazellulären Kompartimenten realistisch auf einem Ansatz, nämlich Elektronenstrahlmikroanalyse (ESMA) begrenzt. EPMA ist eine Technik, die Paare ein Röntgenspektrometer mit einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM). Die TEM-Elektronenkanone konzentriert sich eine stationäre, Submikron Elektronensonde auf subzellulärer Region von Interesse und den elementspezifischen Röntgenstrahlen als Folge der Elektronenbeschuss emittiert werden, werden gesammelt und analysiert (siehe Referenzen ^{7, 4} für technische Detailbewertung). Vorteile der ESMA sind einzelne Organellen-Level-Auflösung und Empfindlichkeit submillimolaren. In der Praxis jedoch, ESMA erfordert spezielle cryotechniques und Instrumente für die Probenvorbereitung und Analyse. Hier werden die Werkzeuge, Techniken und Instrumente für die Messung von intrazellulären Kalzium mittels ESMA entsprechende beschrieben. Intramitochondrialen Kalzium ist besonders interest wegen der entscheidenden Rolle, dass die mitochondriale Calciumüberladung spielt bei neurodegenerativen Erkrankungen.

Protocol

Der hier beschriebene Ansatz wurde mit spezifischen Instrumente, Tools und Software entwickelt. Da Labors werden nicht mit der gleichen Versuchsanordnung werden der Ansatz verallgemeinert, wo möglich.

1. Schnelles Einfrieren

Die Analysemethode beschrieben ist absolut abhängig von kryogenen Ansätze: 1) der "Kryofixation" von Zellen oder Geweben in einer Weise, die quantitativ bewahrt die Verteilung der diffundierbaren Gewebekomponenten und chemische Elemente wie sie in lebenden Zellen zum Zeitpunkt des Einfrierens und 2) die Herstellung von ultradünnen Gefrierschnitten geeignet für in einer TEM-Abbildung und Analyse. Diese Techniken werden hier kurz beschrieben, aber notwendigen Angaben, um diese Verfahren in anderen Laboratorien reproduzieren würde den Rahmen dieses Artikels. Interessierte Leser sind, exzellenten Artikeln ^9,14 bezeichnet.

Achtung: Dieser Abschnitt beschreibt die Verwendung von liquefied Ethan, die leicht entzündliche und explosions ist, entsprechende Vorkehrungen getroffen werden sollten. Betreiber müssen ebenfalls mit flüssigem Stickstoff vertraut sein (LN ₂₎ Sicherheitsmaßnahmen, einschließlich Schutzmantel, Gläser und cryoresistant Handschuhe. Hinweis: Hier und überall, alle Werkzeuge (Zange, etc.) für die Handhabung gefrorenen Proben müssen in LN ₂ vor der Verwendung vorgekühlt werden, um ein versehentliches Auftauen zu vermeiden.

Kultivierte Zellen auf Deckgläsern

1. Bereiten Sie eine Tauchgefriergerät durch Kondensation von gasförmigen Ethan bei -160 ° C in der LN ₂ gekühlten Zentral gut. Bis zur Marke auffüllen und decken die gut mit der Schwenk Alu-Deckel, wenn sie nicht in Gebrauch ist.
2. Mit Filterpapier Keile, unter geeigneten Bedingungen experimentell zu einem dünnen Wasserfilm tupfen Kunststoff-Deckgläser von kultivierten Zellen. Tupfen Sie von der Kante um zu vermeiden, berühren das Gewebe, das Ideal Restfilm, durch Versuch und Irrtum bestimmt wird, ist so dünn wie möglich, aber nicht so thim zu verdampfen und trocknen der Gewebeoberfläche.
3. Halten Sie das Deckglas durch die Kante mit Spannzangen, schnell in flüssigem Ethan eintauchen, entweder manuell oder mit Hilfe der Schwerkraft betriebene Kolben.
4. Legen Sie die gefrorenen Deckglas in einem nahe gelegenen Styropor-Schale mit LN _2, groß genug, um die gewünschte Anzahl von Deckgläsern in langfristige Lagerbehälter zu manipulieren. Aluminium-Schraubverschluss Dosen, die nicht unter LN ₂ ergreifen, werden empfohlen.

Schockgefrieren von kultivierten Hirnschnitten

5. Unter einem Binokular, ansehen und Orient ein organotypischen Hippocampus-Scheibe, ungestört und immer noch auf die Kultur Membraneinsatz befestigt. Zeigen Markierungszeichen auf der Membran in der Nähe der Kante der Scheibe mit einem schwarzen Sharpie-Typ-Stift und Foto.
6. Noch unter dem Mikroskop, schneiden Sie ca.. 5 x 5 mm Membran Quadrate mit einzelnen Scheiben auf den Plätzen zentriert. Berühren Sie nicht die Scheibe oder Biegen der MembranE.
7. Montieren Sie einen Membran-gestützte Scheibe, durch eine im Durchmesser ¼ Agar-Pad gepolstert, auf einem kundenspezifischen Aluminiumscheibe, um einen cryoultramicrotome (siehe unten) passen. Schnell frieren die Scheibe durch pneumatisch treibt es gegen eine _{LN2-gekühlten} Saphirblock mittels eines maßgeschneiderten "slam Einfrieren"-Gerät.
8. Bewegen Sie den Speicher für kultivierten Zellen beschrieben.

2. Kryoschneiden

Vorab: Erfolgreich produzieren Trockenschnitt-Bänder von Ultradünnschnitten, während einfach und logisch, erfordert Übung, Geduld und erheblichen Praxis.

1. Backen Sie einen cryoultramicrotome mit einem cryoattachment und kühl bis -135 ° C ausgestattet
2. Schneiden gefroren in ca. Deckgläser. 3 x 3 mm Quadrate mit einem scharfen, vorgekühlt Skalpell. Einbetten Stücke mit Kulturen nach oben in einer viskosen Flüssigkeit "cryoglue" (1:6 Gemisch aus Ethanol und 2-Propanol ¹¹⁾ auf Standard-3mm Durchmesser aus Aluminium entwickelt, um die Pins Mikrotom Probe Futter passen. Vermeiden undicht cryoglue auf Kulturfläche. Festigen cryoglue durch Absenken der Temperatur auf Kryoboxen -160 ° C ≤
   • Für tiefgefrorene Hirnschnitten, sicher direkt befestigen Scheiben zu einem maßgeschneiderten Spannfutter Probe mittels einer Schraube Kragen.
3. Trim ausgewählten Bereichen der gefrorenen Proben - zB Zellreichen Gebieten des Deckglases Stück oder den Bereichen von Scheiben - zu einer ca.. 250 x 250 um Block Gesicht und ~ 100 um Tiefe mit einem Diamantschneidwerkzeug.
4. Dry-Cut-Bänder von Dünnschnitten bei ca.. -160 ° C mit einer 35 ° Diamant cryoknife, im wesentlichen wie in referencs ^{4, 9} beschrieben. Schnittgeschwindigkeit und Messer Freiwinkel werden empirisch bestimmt, ein guter Ausgangspunkt ist 0,4 bis 0,6 mm / sec bei 9 °. Die Nenndicke, dh Probe voraus, von hydrierten Schnitte iist typischerweise 80 nm, obwohl Abschnitte tatsächlich 1,5-2.0x dicker, hauptsächlich aufgrund der Kompression. Für eine einwandfreie Schnitte, ist ein Antistatikvorrichtung notwendig. Setzen Sie den ionisierenden Spitze der Geräte 0,5-1 cm von der Messerkante und stellen Ausgangsleistung, bis eine zufriedenstellende Bänder von Abschnitten hergestellt werden.
5. Bereiten Wimpern Sonden durch Kleben (mit Epoxy) Wimpern Applikator Holz-Sticks. Mit einer solchen Sonde, Abholung und Transfer Abschnitte aus dem Messerrücken auf glow-entladen, Kohlenstoff-beschichteten Trägerfolien PIOLOFORM über 100-Mesh-Klappkupfergitter gegossen und auf einem Halb gefaltet Indiumfolie Umschlag auf einem Regal hinter ruhenden Arbeits das Messer. Falten Sie die obere Hälfte des Rasters und Umschlag, drücken Sie mit einem Kaltpresswerkzeug.
6. Übergitter eingewickelt in einem geeigneten Gitterbox und Speicher in einem Aluminium kann, wie in Schritt 1.4 beschrieben.

3. Schockgefrierungsobjekthalter von Proben in die Elektronen-Mikroskop

Das Kerninstrument für die ESMAin diesem Labor ist eine analytische Elektronenmikroskop bei 120 kV betrieben und für Kryomikroskopie ausgestattet, das heißt, mit einem sauberen Vakuum, Probe-Gebiet anticontaminator, einer 2k x 2k hochempfindlichen Digitalkamera und Schockgefrierungsobjekthalter Probenhalter entworfen. Überprüfen Sie vorher, Mikroskop Ausrichtung und Betriebsbedingungen in beiden Low-und High-Vergrößerung Modi und bestätigen eine zufriedenstellende Spalte Vakuum, idealerweise ≤ 10 ^-7 Torr. Tune up wie nötig.

1. Bestätigen Sie, dass die Vakuum-Isolierung der Dewar-Komponente des cryoholder ist zufriedenstellend. Pumpe nach Bedarf.
2. Kühlen Sie die cryoholder auf die Minimaltemperatur, mindestens -160 ° C, während im Hochvakuum innerhalb der Mikroskoptisch, nehmen Sie das Kabel, das den Halter, seine Steuereinheit. Kippen Sie die Goniometer 45 ° im Uhrzeigersinn, bevor Sie den Inhaber, LN ₂ minimieren Verschütten auf Betreiber und Mikroskop Oberflächen.
3. Bereiten Sie die Tisch cryoworkstation durch Abkühlen des integralen isolierend-Schale auf 160 ° C ≤
4. Transfer (quickly!) die gekühlte cryoholder von Mikroskop, um Cryo Workstation. Einfahren des Inhabers Frostschirm.
5. Rufen Sie unter LN ₂ ein Raster-Sandwich von der Lagerung und Platz auf dem Arbeitstisch des cryoworkstation. Ein Haltering für des Inhabers Probe gut ist auch auf den Tisch gelegt.
6. Öffnen Sie die Indium-Umschlag und bewegen Sie den beiliegenden Klappgitter auf die Probe auch der cryoholder. Sichern Sie das Gitter mit Haltering mit dem Schraubenschlüssel Werkzeug ein und schließen Sie den Frostschutz.
7. Schnelles Entfernen der cryoholder vom cryoworkstation legen und in der Luftschleuse des Mikroskops und gehen durch die Pumpsequenz so schnell wie möglich. Beim Einsetzen, sollte minimale Unterbrechung der Säule Vakuum sein.
8. Zurück Goniometer auf 0 ° Neigung. Schließen Sie neue Energie tanken und das Kontrollkästchen und bestätigen, dass die Probentemperatur ≤ 150 ° C
9. Füllen Sie den Dewar derProbenhalter und ermöglichen Vakuum-und Temperatur vollständig erholen.

4. Visual Survey der § §

1. Fahren Sie den Frostschirm des Inhabers zur Probe aussetzen und schalten Sie den Elektronenstrahl.
2. Visuelle Bewertung der Probe bei geringer Vergrößerung, in der Regel 250X und geringer Beleuchtung. Wie in Abbildung 1 dargestellt ist, sollte Abschnitte dünn und glatt, nicht gefaltet oder überlappenden, flach und gut auf die Trägerfolie angebracht sein, und in der Regel nicht durch Gitterstäbe verdeckt.
3. Optional fotografieren ausgewählten Abschnitten. (HINWEIS: Minimieren Belichtung, da tiefgefrorenen Abschnitte sind sehr anfällig für Strahl-induzierten Schäden.) Verwenden Sie die automatisierte digitale Goniometertisch, um die Koordinaten der ausgewählten Abschnitte zu speichern.

5. Die Gefriertrocknung der § §

1. Gefrier trockenen Abschnitte durch die Erhöhung Halter Temperatur auf ca.. -100 ° C ~ 30 min.
2. Rückkühlung Halter bis -160 ° C oder darunter.

6. Imaging von Zellen und Organellen

Strukturbilder von gefriergetrockneten Abschnitte werden bei ca. erhalten. -160 ° C als low-dose, Zero-Loss-Bilder mit einem 2k x 2k Slow-Scan CCD-Kamera durch entsprechende Software gesteuert digital aufgezeichnet.

1. Aktivieren Sie die EM in hallo-mag-Modus.
2. Wählen und Bild bei ~ 2000 X (als TIFF-Dateien, siehe Abbildung 2) markierten Zellen und subzellulärer Bereiche von Interesse in hochwertigen Abschnitte, deren Standorte waren zuvor aufgezeichnet und gespeichert. (Anmerkung: Die getrockneten Abschnitte sind jetzt wesentlich weniger empfindlich und weniger anfällig für Beschädigungen Elektronenstrahl.
3. Bewerten Sie Bilder, um Regionen von Interesse (ROI) für die Röntgenanalyse auswählen. Dieser Schritt kann wahlweise off-line durchgeführt werden, in welchem ​​Fall die EM gedreht werden kannaus, und die Probe auf Raumtemperatur erwärmen.

7. Akquisition von Röntgenspektren

Röntgenspektren mit einem aufgezeichnet werden mehrere kommerzielle oder kundenspezifische Röntgenanalysesysteme minimal aus einer energiedispersiven Röntgenanalyse (EDX)-Detektor, zugehörigen Impulsprozessor-Elektronik und kompatibel Erfassung und Anzeige-Software. (Der in dieser Übung verwendete System ist in Tabelle 1 beschrieben.)

1. Konfigurieren des EM für die Röntgenaufnahmen durch Einsetzen des EDX-Detektor in der Kolonne (falls erforderlich), Abziehen der Objektivöffnung und Einführen und Zentrieren keine Streustrahlung Öffnungen. Einstellen der cryoholder der niedrigsten Temperatur, bei der Frost Verunreinigung der Probe vermieden wird, sondern zumindest unterhalb -100 ° C
2. Neigen Sie den Halter 20 ° in Richtung des Detektors.
3. Unter Weitfeldabbildungsbedingungen und unter Annahme einer beabsichtigt, die Matrix aus einer analysieren individual Mitochondrien, wählen Sie ein Mitochondrium für die Analyse, verschieben Sie sie in der Mitte des Feldes und den Schwerpunkt.
4. Zum Spot-Modus (bei ​​einigen Mikroskopen nur konvergieren den Strahl mit zweiten Kondensator Fokus) und erhöhen die Strahlstrom auf ca.. 3 nA (wie mit einem Faraday-Cup oder ähnlichen gemessen) in einer 100 nm Ort.
5. Starten Sie das Spektrum Erfassungssoftware und beginnen 100 sec Akquisitionen, die Live-Zeit auf dem Monitor betrachtet werden können. Sparen aufgenommene Spektrum (Abb. 2). Der Industriestandard EMSA-Format bevorzugt.
6. Fahren Sie den EM und übertragen Sie die Multiple-Spektren-Datei (en) zu einem (offline) Analyse-Workstation.

8. Analyse der Röntgenspektren

Qualitative Analyse

Eine EDX-Spektrum (Abbildung 2, Einschub) ist im Wesentlichen eine xy-Darstellung der Röntgenintensität vs Energie. Spectra enthalten qualitative und quantitative Informationen über die elementare Zusammensetzung von ter analysiert, Lautstärke, dass der "charakteristischen" Energie einer Spitzen identifiziert das Element, die zu diesem Gipfel, während die Intensität spiegelt die Menge dieses Elements. Die charakteristischen Peaks reiten auf einem sich langsam verändernden Hintergrund, der "Kontinuum". (Die Legende zu Abbildung 2 weiter diskutiert hervorstechenden Details der EDX-Spektren.) Die Energie der Spitzen Verteiler für das gesamte Periodensystem werden durch die bekannten elektronischen Struktur von Elementen, wodurch alle EDX Software Links zu einer Datenbank, die automatisch identifiziert Komponenten definiert ein Analyt. In einem physiologischen Kontext, Elemente von allgemeinem Interesse, die gut auf EDX-Analyse sind, umfassen Na (K _α bei 1,04 keV), P (2,01 keV), K (3,31 keV) und Ca (3,69 keV).

1. Profitieren Sie von der verfügbaren Software-Datenbank und Spitzenpassenden Routinen, um wichtige Elemente in den Spektren zu identifizieren. In einer biologischen Probe zu erwarten Peaks für Na, Mg, P, S, Cl, K und Ca zu finden. (ACHTUNG:Die letzten beiden Elemente überlappen!)

Quantitative Analyse

Die quantitative Analyse der EDX-Spektren aus der Extraktion der integrierten Fläche der Peaks identifiziert und Konvertieren dieses Wertes in einer Konzentration. Für biologische Analyse ist die etablierten Ansatz der Hall Peak / Kontinuum Verfahren ^4,7,10, die Nutzen aus der Tatsache, dass die Intensität des Kontinuums (oben und in Abbildung 2 definiert) ist proportional zu der Trockenmasse des analysierten Volumen nimmt . Somit ist das Verhältnis der Peakfläche / Kontinuum Bereich, verglichen mit dem gleichen Verhältnis in Spektren von Standards bekannter Zusammensetzung, gibt die Konzentration in der Ziel Zellkompartiment. Beachten Sie, dass dieser Ansatz Konzentrationen in Einheiten von Mol pro Gewicht, in der Regel als mmol / kg Trockengewicht ausgedrückt. Diese Einheit ist ungewöhnlich und für die Interpretation erfordern zusätzliche Umwandlung in zB mmol / L Nassgewicht oder mmol / mg Protein, wie beschrieben elsewhere ^4,10.

2. Extrahieren Peakflächen (und Fehlerschätzungen) biologischer Elemente zwischen Z = 10-20 (0,5-4,0 keV), dh Na, Mg, P, S, Cl, K, Ca und unter Verwendung einer der Routinen in den Fitting-Analyse-Software gebaut (siehe Tabelle 1, insbesondere Fußnote 4). Dieses Labor verwendet Simplex-oder Mehr kleinsten Quadrate. Beachten Sie, dass diese Montage erfordert eine sorgfältige Aufmerksamkeit auf die Lösung der Überlappung zwischen K-und Ca-Gipfel (siehe Abbildung 2).
3. Integrieren Sie das Kontinuum zwischen 1,45-1,61 keV. Alternative störungsfreien Bereiche können verwendet werden.
4. Berechnen Peak / Kontinuum Verhältnisse und dann Konzentrationen im Vergleich zu Standards. Propagieren Fehler während der gesamten Analyse.
5. Verwenden Sie Standard-Statistik-Software und Formeln, um Durchschnittswerte, die biologische Variabilität widerspiegeln schätzen.

Representative Results

Gehirnzellen zu erhalten in der Regel exzitotoxische Verletzungen als Folge des pathologischen Neurotransmitter-Freisetzung, die unter ischämischen Bedingungen auftritt. ESMA war entscheidend für die Entdeckung, wie die Fähigkeit der neuronalen Mitochondrien, riesige Mengen an Kalzium zu maskieren zugrunde liegt, den Mechanismus der Verletzung. Die elektronenmikroskopische Aufnahme in Fig. 3 veranschaulicht das Aussehen von Mitochondrien in gefriergetrockneter Gefrierschnitten von kultivierten hippocampalen Neuronen schnell nach 30 min Exposition bei einem exzitotoxischen Stimulus (100 uM NMDA) eingefroren. Die meisten Mitochondrien scheinen strukturell beschädigt werden, da sie sehr geschwollen und enthalten kleine, dunkle Einschlüsse (rote Pfeile). ESMA, die Auflösung ausreichend ist, um innerhalb der Elementaranalyse und exklusive des ("Matrix") mitochondriale Einschlüsse (Abbildung 3, rote und blaue Spektren bezeichnet) durchzuführen hat, ergab, dass die Einschlüsse sind weitgehend von Kalzium und Phosphor besteht. Die extrem hohe Kalzium conZelt dieser Einschlüsse - ~ 1.300 mmol / kg Trockengewicht, während <1 mmol / kg ist typisch für Ruhe Mitochondrien - erklärt ihre außergewöhnlichen Kalzium-Pufferkapazität, und warum diese überwältigende Puffermechanismus führt zu Calciumüberladung ausgelösten Zelltod ^11.

Hippocampus, ein Bereich des Gehirns von entscheidender Bedeutung für Lernen und Gedächtnis, ist ein wichtiger Ort der Schädigung nach Ischämie. Interessanterweise und therapeutisch wichtig ist, ist die funktionell unterschiedlichen Region benannt CA3 weit weniger anfällig für ischämische Verletzungen, als der angrenzende, synaptisch verbunden CA1-Region. EMPA-Analyse - in Verbindung mit Gefrierschnitten von bestimmten Regionen des Hippocampus, die in situ Struktur und Funktion (Abbildung 4, Aufnahme) zu halten - wurde benutzt, um zu zeigen, dass toxische Stimuli induzieren viel größer Kalzium Erhebungen in gefährdeten CA1-Neuronen als in benachbarten beständig CA3 Neuronen ( Abbildung 4, Balkendiagramm). Folglich CA1 Mitochondrien dria zeigen umfangreiche Verletzungen und Funktionsstörungen, die anzeigt, dass Ca ^{2 +-Überlast-induzierte} mitochondriale Dysfunktion ist ein entscheidender Faktor bei der selektiven Anfälligkeit der CA1-Neuronen ^13.

Fig. 1 ist. Low-Vergrößerung elektronenmikroskopische Aufnahme von zwei Bändern aus tiefgefrorenen Gefrierschnitten auf einem PIOLOFORM Film unterstützt. Merkmale einer guten Vorbereitung dargestellt sind, einschließlich flach anliegend, minimal fragmentiert Abschnitte. Gitterquadrate mit Rippen in der Trägerfolie sollte vermieden werden, da der Film reißt weiter unter dem Elektronenstrahl. Zwei Plätze für die Analyse ganz angemessen sind durch * gekennzeichnet. Maßstabsbalken = 100 um.

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2. Die quantitative Analyse der elementaren Zusammensetzung von Organellen ESMA. Low-dose, digitale Rastertransmissionselektronenmikroskopische Aufnahme von sympathischen Neuron in einem gefriergetrockneten Kryoschnitt von schnell gefroren Steuer Ganglion vorbereitet zeigt das Detail in solchen Exemplaren erreicht werden. Beachten Sie die scharfen Plasmamembran, gut erhalten Stapel des endoplasmatischen Reticulum und reichlich Mitochondrien Inset -. EDX-Spektrum eines typischen Bereich der mitochondrialen Matrix aufgezeichnet, wie durch den roten Punkt gekennzeichnet. Elemente, die den großen K-Schale-Röntgenpeaks identifiziert, im Falle von Kalium und Calcium, zwei K-Schale-Linien, die durch alternative elektronische Übergänge gelöst werden, angegeben als K _α und K _β nach spektroskopische Standardnotation. Spectrum zeigt typische Verteilung der wichtigsten Elemente in lebenden Nervenzellen. Beachten Sie die langsam variiereKontinuumsStrahlung, beispielsweise zwischen 1,5-1,8 oder 2,8-3,1 keV, was die Massendichte dieses Zellkompartiment reflektiert. Quantitative Analyse von Calcium in gesunden Zellen durch die Anwesenheit von relativ hohen Konzentrationen von Kalium (ca. 500 mmol / kg Trockenmasse, ungefähr äquivalent zu 150 mM), die zu einer Überlappung der Kalium-und _Calcium-β K K _α Peaks gibt kompliziert in der EDX-Spektrum. Es gibt Standard-Algorithmen für Entfalten diese Überlappung. Maßstabsbalken entspricht 1 um.

3. Exzitotoxischer Stimulation induziert variabel und lokalisierten Calciumakkumulation im einzelnen Mitochondrien. Digitale transmissionselektronenmikroskopische Aufnahme eines gefriergetrockneten Kryoschnittes hergestellt aus nicht fixierten, schnell gefrorenen Hippocampus-Zellkultur nach exzitotoxische Stimulation des NMDA-Subtyp der Glutamat-Rezeptoren (100 uM NMDA für 30 min) zeigt zahlreiche Mitochondrien, die kleine, natürlich elektronendichte, punktförmige Einschlüsse (rote Pfeile). Entsprechende Röntgenspektren zeigen, dass toxische Stimulation führte zu Verlust von Ionen-Homöostase, wie durch erhöhte Na Spitze belegt und reduzierte K Höhepunkt in der Aufnahme frei mitochondrialen Matrix (blaue Pfeile und Spektrum). Die große Ca Spitzen im roten Spektrum spiegelt die starke mitochondriale Kalzium Anhäufung charakteristische Einschlüsse, die auch große Mengen an Phosphor und Sauerstoff enthalten lokalisiert. Durchschnittliche Ca-Konzentration in Einschlüssen und Matrizen war ~ 1300 und ~ 60 mmol / kg Trockengewicht. Maßstabsbalken entspricht 500 nm aufweisen.

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4. Mitochondriale Calciumüberladung ist für die selektive ischämischen Anfälligkeit der Hippocampus-CA1-Neuronen verantwortlich linken Seite -. Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Gefrierschnitten von Zellkörper in der CA3 und CA1-Regionen eines organotypischen hippocampalen Schnittkultur, schnell unter Ischämie-ähnlichen Bedingungen (100 uM NMDA) eingefroren. rechte Tafel - EPMA analysiert mitochondriale Calciumgehalt zeigt, dass chemische Ischämie induziert viel größer Calcium Erhebungen in Mitochondrien von gefährdeten CA1 Neuronen als in benachbarten, Ischämie festen CA3-Neuronen (*, p <0,05 in Bezug auf NMDA-exponierten CA1). NMDA-induzierte Calciumüberladung wurde von NMDAR-Antagonisten MK-801 abgeschafft. Maßstabsbalken entspricht 2 um.

Discussion

Die hier vorgestellte Elektronenmikroskop-basierten Analysemethode ermöglicht die Detektion, Identifizierung und Quantifizierung von mehreren Elementen von biologischem Interesse, einschließlich Na, K, P, insbesondere Ca. Diese Analysen können bei subzellulärer geführt werden, dh, intra-Organellen, die Auflösung aufgrund der Fähigkeit, zu lokalisieren und zu identifizieren Strukturen von Interesse in Bildern hoher Qualität von Gefrierschnitten aus rasch eingefroren Proben vorbereitet. Beachten Sie, dass keine Färbung ist erforderlich, um vergleichbare Elektronenbilder in Strukturqualität zu konventionell festgelegt, Kunststoff eingebetteten Präparate aufnehmen, auch wenn die Lage der Gewebeelemente quantitativ erhalten.

Obwohl Strukturerhebung Bilder werden mit niedrigen angelegten Elektronendosis aufgezeichnet sind, werden viel höhere Dosen erforderlich, um X-ray Emission bei Impulsraten ausreichen, um gute Statistiken zu erhalten, zu entlocken. Daher muss ein Mikroskop nützlich für die EMPA in der Lage, eine hohe Strom fokussierten Sonde zu bilden; 2-5 nAin 25-50 nm, geeignet für umfassende Organellen wie ER-Zisternen oder synaptischen Vesikeln, ist akzeptabel. Diese minimal erfordert eine hohe Helligkeit Lanthanhexaborid Elektronenkanone. Unter diesen instrumentellen Bedingungen kann Kalzium bei typischen Gewebekonzentrationen von 1 bis 10 mmol / kg Trockengewicht quantitativ in einen Standardfehler von ± 0,1 mmol / kg in ~ 100 sec Live-Zeit analysiert werden. Die Empfindlichkeit des Calcium-Analyse würde erheblich verbessert werden, wenn es nicht für die unglückliche Überschneidung der wichtigsten Kalzium-x-ray-Linie mit einer kleinen Kalium-Linie, Entfaltung von denen fügt bedeutende Unsicherheit für die Integration des Calciumsignals (siehe Abbildung 1 Legende für Details). Beachten Sie, dass die beschriebenen Randbedingungen sind sehr entspannt, wenn die lokalen Calciumkonzentrationen sind ungewöhnlich hoch, da während der physiologischen und pathologischen besonders, mitochondriale Kalzium-Akkumulation (Abb. 2-3) auftritt.

Trotz zahlreicher successful-Anwendungen, ist es klar, dass ESMA ist keine besonders effiziente Technik, so gibt es viel Anreiz, den Datendurchsatz zu verbessern. Drei viel versprechende Wege werden hier genannt: 1) Elektronen-Energieverlust-Spektroskopie (EELS) statt EDX, 2) 2D-Element zugeordnet wird, anstatt Punkt-Sonden, und 3) neue, state-of-the-Art-Instrumentierung. Anstatt Sammeln emittierten Röntgenstrahlen, EELS hängt Aufnahme einfallenden Elektronen, die charakteristisch, elementspezifischen Energiemengen nach Elektronen / Atom Kollisionen verloren. Statistisch gesehen, ist von Natur aus EELS ~ 4x besser als EDX und EELS-Hardware und-Software werden jetzt praktisch reif für Biologen. (Siehe Referenzen ^{6, 2} für Bewertungen von EELS-Anwendungen in der Biologie.)

Die verbesserte Empfindlichkeit durch EELS angeboten - und auch von den neueren Hochdurchsatz-Si-Drift-Detektoren EDX, siehe unten - ermöglicht kürzere Verweilzeiten pro Analyse, beispielsweise Millisekunden anstatt hundreds Sekunden, und damit die Fähigkeit, digitale Karten von ausgewählten Gebieten in angemessenen Zeiten zu generieren. Als ein Beispiel kann ein 128 x 128 Calcium Karte in ~ 1 h ¹ aufgezeichnet werden. Beachten Sie, dass dieser Ansatz, wie "Spektrum imaging" ^6,2 bekannt, bietet ein komplettes Spektrum EELS an jedem Pixel, so dass Informationen über verschiedene Elemente in der aufgezeichneten "Datenwürfel" embedded (x vs. Y vs. E).

Schließlich gab es inhaltliche Fortschritte in der Gerätetechnik und die Leistung, da das gegenwärtige System, wie im Protokoll beschrieben, wurde vor über 20 Jahren entwickelt. State-of-the-art Technologie, das wäre zum guten Ton in einem EMPA-Labor als Setup würde heute sind: 1) eine High-Brightness-Feldemissionskanone, die mehrere Nanoampere (nA) der Strom in Sub-Nanometer-Größe Spots pumpen kann, 2. ) eine großflächige Silizium-Drift-Detektor für maximale Röntgensammeleffizienz und Durchsatz ⁸ und 3) modernen Softwarebietet überlegene Flexibilität und Leistung für die spektrale Erfassung, Analyse und Quantifizierung. Solche Software-Pakete sind von den meisten Herstellern im Handel erhältlich, alternativ ist eine aktualisierte und verbesserte Version des DTSA-Software, DTSA II, kostenlos erhältlich von NIST (siehe Tabelle 1, Fußnote 4). Die eben beschriebenen Funktionen sind auf jeder Automatisierung und / oder in der Robotik auf der Basis Elektronenmikroskop.

Die wie beschrieben EMPA-Protokoll hat sich sehr nützlich für den Angriff auf mehrere Fragen von Interesse für Neurowissenschaftler, helfen, zum Beispiel, um zelluläre Mechanismen der Neurodegeneration zeigen bewährt. Betrachtet man die Verbesserungen nur zu empfehlen, sollte EMPA weiterhin ein fester Faktor für die zukünftige Forschung sein.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS/MATERIALS
Thermanox plastic coverslips	Thermo Fischer Scientific	72280
Culture inserts	BD Falcon	353090	For 6-well plates
Cryopins	Leica Microsystems	16701952	Grooved
Wood applicators	EM Sciences	72300
Folding EM grids	Ted Pella	4GC100/100	100 mesh
Indium foil	Alfa Aesar	13982	0.25 mm thick
EQUIPMENT
Plunge freezing device	Leica Microsystems	KF-80
Slam freezing device	LifeCell	CF-100
Ultramicrotome	Leica Microsystems	UC6
Cryoattachment for microtome	Leica Microsystems	FC6
Diamond cryotrimming tool	Diatome	Cryotrim 45
Diamond cryoknife	Diatome	Cryo 35
Antistatic device	Diatome	Hauf Static Line
Cryo electron microscope	Carl Zeiss Microscopy	EM912 Omega
EM cryo specimen holder	Gatan	CT3500
Slow-scan CCD camera, 2k x 2k	Troendle (TRS)	Sharpeye
Image acquisition software	Olympus SIS	iTEM suite
ED x-ray detector	Oxford Instruments	Linksystem Pentafet
Pulse Processor	Oxford Instruments	XP-3
PCI backplane card	4pi Systems	Spectral Engine II
Desktop computer	Apple	Any OS9-compatible model
X-ray analysis software	NIST	DTSA, DTSA II
Spreadsheet software	Microsoft	Excel
The CF100 is no longer sold commercially, although the machine is available at many academic facilities, and complete machines or parts can be found on-line. A video tutorial for the CT3500 cryotransfer holder is available at http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4. The SEII is obsolete; the Universal Spectral Engine Is a later, PC-compatible product with comparable functionality. 4pi has ceased manufacturing and sales but still provides technical customer support. Used systems are often found online. The original DTSA is now obsolete. NIST offers in the public domain an updated successor, DTSA II 12 (http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm)