JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생체공학

Aplysie Préparation des ganglions pour les analyses électrophysiologiques et moléculaires de neurones simples

Published: January 13, 2014
doi:
10.3791/51075
, ,
1Department of Neuroscience,The Scripps Research Institute, Florida

Summary

L’escargot marin Aplysia californica a été largement utilisé comme modèle de neurobiologie pour les études sur la base cellulaire et moléculaire du comportement. Ici, une méthodologie est décrite pour explorer le système nerveux d’Aplysia pour les analyses électrophysiologiques et moléculaires de neurones uniques de circuits neuronaux identifiés.

Abstract

Un défi majeur en neurobiologie est de comprendre les fondements moléculaires des circuits neuronaux qui régissent un comportement spécifique. Une fois que les mécanismes moléculaires spécifiques sont identifiés, de nouvelles stratégies thérapeutiques peuvent être développées pour traiter les anomalies dans des comportements spécifiques causés par des maladies dégénératives ou le vieillissement du système nerveux. L’escargot marin Aplysia californica est bien adapté aux investigations de la base cellulaire et moléculaire du comportement parce que les circuits neuronaux sous-jacents à un comportement spécifique pourraient être facilement déterminés et les composants individuels des circuits pourraient être facilement manipulés. Ces avantages de l’Aplysia ont conduit à plusieurs découvertes fondamentales de la neurobiologie de l’apprentissage et de la mémoire. Ici, nous décrivons une préparation du système nerveux d’Aplysia pour les analyses électrophysiologiques et moléculaires des neurones individuels. En bref, le ganglion disséqué du système nerveux est exposé à la protéase pour enlever la gaine ganglionnaire de telle sorte que les neurones soient exposés mais conservent l’activité neuronale comme chez l’animal intact. Cette préparation est utilisée pour effectuer des mesures électrophysiologiques de neurones simples ou multiples. Il est important de noter qu’après l’enregistrement à l’aide d’une méthodologie simple, les neurones pourraient être isolés directement des ganglions pour l’analyse de l’expression génique. Ces protocoles ont été utilisés pour effectuer des enregistrements électrophysiologiques simultanés à partir de neurones L7 et R15, étudier leur réponse à l’acétylcholine et quantifier l’expression du gène CREB1 dans des neurones L7, L11, R15 et R2 uniques isolés d’Aplysia.

Introduction

Le cerveau humain est extraordinairement complexe avec près de 100 milliards de neurones et des billions de connexions synaptiques. Il existe un nombre presque égal de cellules non neuroneuronales qui interagissent avec les neurones et régulent leur fonction dans le cerveau. Les neurones sont organisés en circuits qui régulent des comportements spécifiques. Malgré les progrès réalisés dans notre compréhension des fonctions cérébrales et des circuits neuronaux, on sait peu de choses sur l’identité des composants des circuits qui contrôlent un comportement spécifique. La connaissance des identités de divers composants d’un circuit facilitera grandement notre compréhension de la base cellulaire et moléculaire du comportement et aidera à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les troubles neuropsychiatriques.

L’escargot marin Aplysia californica a été un cheval de bataille pour déterminer les circuits neuronaux sous-jacents à des comportements spécifiques1-14. Le système nerveux d’Aplysia contient environ 20 000 neurones qui sont organisés en 9 ganglions différents. Les neurones de l’Aplysia sont grands et peuvent être facilement identifiés en fonction de leur taille, propriétés électriques, et la position dans les ganglions. Aplysia a un riche répertoire de comportements qui peuvent être étudiés. L’un des comportements bien étudiés est le réflexe de retrait des branchies (GWR). Les composants centraux de ce réflexe sont situés dans les ganglions abdominaux. Les composantes des circuits de la régression pondérée géographiquement ont été cartographiées et les contributions de divers composants ont été déterminées. Il est important de faire en charge les circuits de régression pondérée géographiquement par5,6,15-19. Des décennies d’étude sur ce réflexe ont également identifié plusieurs voies de signalisation qui ont un rôle clé dans l’apprentissage et la mémoire20-24.

Plusieurs préparations différentes d’Aplysia ont été employées pour étudier la base cellulaire et moléculaire du stockage de mémoire. Il s’agit notamment de l’animal intact2,3,de la préparation semi-intacte1,7,13,14,16 et de la reconstitution des principaux composants des circuits neuronaux25-29. Une préparation réduite pour explorer des ganglions d’aplysie pour les analyses électrophysiologiques et moléculaires des circuits neuronaux identifiés est décrite ici. Les quatre neurones identifiés suivants ont été étudiés. R15, un neurone éclatant, L7 et L11, deux neurones moteurs différents et R2, un neurone cholinergique ont été étudiés. R2 est le plus grand neurone décrit dans le système nerveux des invertébrés. En bref, cette méthodologie implique le traitement de la protéase des ganglions, des mesures électrophysiologiques avant et après les traitements pharmacologiques, et l’isolement des neurones simples pour l’analyse quantitative de l’expression des gènes. Cette méthodologie nous permet de combiner des analyses moléculaires avec l’enregistrement simultané de plusieurs neurones. Cette méthodologie a été avec succès employée pour étudier des réponses des neurones R15 et L7 à l’acétylcholine (Ach) par les enregistrements intracellulaires appariés. Après des mesures électrophysiologiques R15 et L7 et d’autres neurones identifiés tels que L11 et R2 ont été isolés pour l’analyse quantitative de l’amplification en chaîne par réaction (qPCR) de l’expression de CREB1, un facteur de transcription important pour le stockage de mémoire.

Protocol

1. Préparation des ganglions abdominaux, mesures électrophysiologiques et isolement de neurones identifiés uniques à partir du ganglion abdominal d’Aplysia californica Maintenir Aplysia dans l’aquarium de laboratoire avec de l’eau de mer artificielle circulante (ASW) à 16 °C dans des conditions claires:sombres à 12:12. Isolement de ganglion abdominal. Anesthésier les animaux en injectant une solution de MgCl2 de 380 mM pendant 5 à 10 minutes (équiva…

Representative Results

Le poids des animaux utilisés dans cette étude variait de 100 à 200 g. Suivant les protocoles décrits, nous avons effectué des mesures électrophysiologiques et l’analyse moléculaire des neurones des ganglions abdominaux isolés chez les animaux s’étendant de 2-5 g à 200-300 g. La normalisation du traitement de protéase est importante pour des mesures électrophysiologiques réussies des neurones dans les ganglions. Initialement, des concentrations et des durées multiples de prot…

Discussion

Le neurone R15 est impliqué dans la régulation des systèmes cardiovasculaire, digestif, respiratoire et reproducteur30. Une activité d’éclatement régulièrement rythmique de l’AP est une caractéristique de R15. Comme le montre la section des résultats, l’enregistrement apparié de R15 et L7 montre que la préparation des ganglions a préservé l’activité des neurones R15. Les neurones R15 et L7 ont répondu convenablement à Ach. Cette préparation de ganglions a pu être maintenue jusqu’à …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions sincèrement la Fondation Whitehall pour son soutien financier et les fonds de démarrage du Scripps Research Institute pour la réalisation de ce travail.

Materials

Aplysia National Aplysia Resource Facility, University of Miami
NaCl SIGMA S 3014-1KG
KCl SIGMA P 9333-500G
CaCl2•2H2O SIGMA C5080- 500G
MgCl2•6H2O Fisher Scientific BP 214-501
NaHCO4 SIGMA S 6297-250G
HEPES SIGMA H 3375-500G
Protease GIBCO 17105-042
Trizol Ambion 15596-026
Chloroform MP Biomedicals 2194002
100% Ethanol ACROS 64-17-5
GlycoBlue Ambion AM9515
3 M NaOAc, pH 5.5 Ambion AM9740
Nuclease free water Ambion AM9737
MessageAmp II aRNA Amplification Kit Ambion AM1751
qScript cDNA SuperMix Quanta Biosciences 95048-100
Power SYBR Green PCR Master Mix Applied Biosystems 4367659
Forceps Fine Science Tools 11252-20
Scissors Fine Science Tools 15000-08
Stainless Steel Minutien Pins  Fine Science Tools 26002-10 or
26002-20
Veriti Thermal Cycler Applied Biosystems Veriti Thermal Cycler
5430R Centrifuge Eppendorf 5430R Centrifuge
7900HT Fast Real-Time PCR Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR
Amplifier BRAMP-01R NPI Electronics
Digidata Converter Instrutech ITC-18 HEKA ELEKTRONIK
Micro Manipulator Patch Star Scientifica
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cleary, L. J., Byrne, J. H., Frost, W. N. Role of interneurons in defensive withdrawal reflexes in Aplysia. Learn. Mem. 2, 133-151 (1995).
  2. Elliott, C. J., Susswein, A. J. Comparative neuroethology of feeding control in molluscs. The J. Exp. Biol. 205, 877-896 (2002).
  3. Nargeot, R., Simmers, J. Functional organization and adaptability of a decision-making network in Aplysia. Front. Neurosci. 6, 113 (2012).
  4. Baxter, D. A., Byrne, J. H. Feeding behavior of Aplysia: a model system for comparing cellular mechanisms of classical and operant conditioning. Learn. Mem. 13, 669-680 (2006).
  5. Castellucci, V., Pinsker, H., Kupfermann, I., Kandel, E. R. Neuronal mechanisms of habituation and dishabituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Science. 167, 1745-1748 (1970).
  6. Castellucci, V. F., Carew, T. J., Kandel, E. R. Cellular analysis of long-term habituation of the gill-withdrawal reflex of Aplysia californica. Science. 202, 1306-1308 (1978).
  7. Dembrow, N. C., et al. A newly identified buccal interneuron initiates and modulates feeding motor programs in Aplysia. J. Neurophysiol. 90, 2190-2204 (2003).
  8. Fredman, S. M., Jahan-Parwar, B. Command neurons for locomotion in Aplysia. J. Neurophysiol. 49, 1092-1117 (1983).
  9. Jing, J., Vilim, F. S., Cropper, E. C., Weiss, K. R. Neural analog of arousal: persistent conditional activation of a feeding modulator by serotonergic initiators of locomotion. J. Neurosci. 28, 12349-12361 (2008).
  10. McManus, J. M., Lu, H., Chiel, H. J. An in vitro preparation for eliciting and recording feeding motor programs with physiological movements in Aplysia californica. J. Vis. Exp. (4320), (2012).
  11. McPherson, D. R., Blankenship, J. E. Neuronal modulation of foot and body-wall contractions in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 67, 23-28 (1992).
  12. Miller, N., Saada, R., Fishman, S., Hurwitz, I., Susswein, A. J. Neurons controlling Aplysia feeding inhibit themselves by continuous NO production. PloS one. 6, (2011).
  13. Perrins, R., Weiss, K. R. A cerebral central pattern generator in Aplysia and its connections with buccal feeding circuitry. J. Neurosci. 16, 7030-7045 (1996).
  14. Xin, Y., Weiss, K. R., Kupfermann, I. An identified interneuron contributes to aspects of six different behaviors in Aplysia. J. Neurosci. 16, 5266-5279 (1996).
  15. Carew, T. J., Castellucci, V. F., Byrne, J. H., Kandel, E. R. Quantitative analysis of relative contribution of central and peripheral neurons to gill-withdrawal reflex in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 42, 497-509 (1979).
  16. Cohen, T. E., Kaplan, S. W., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. A simplified preparation for relating cellular events to behavior: mechanisms contributing to habituation, dishabituation, and sensitization of the Aplysia gill-withdrawal reflex. J. Neurosci. 17, 2886-2899 (1997).
  17. Frost, L., et al. A simplified preparation for relating cellular events to behavior: contribution of LE and unidentified siphon sensory neurons to mediation and habituation of the Aplysia gill- and siphon-withdrawal reflex. J. Neurosci. 17, 2900-2913 (1997).
  18. Frost, W. N., Castellucci, V. F., Hawkins, R. D., Kandel, E. R. Monosynaptic connections made by the sensory neurons of the gill- and siphon-withdrawal reflex in Aplysia participate in the storage of long-term memory for sensitization. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8266-8269 (1985).
  19. Hawkins, R. D., Greene, W., Kandel, E. R. Classical conditioning, differential conditioning, and second-order conditioning of the Aplysia gill-withdrawal reflex in a simplified mantle organ preparation. Behav. Neurosci. 112, 636-645 (1998).
  20. Hawkins, R. D., Clark, G. A., Kandel, E. R. Operant conditioning of gill withdrawal in Aplysia. J. Neurosci. 26, 2443-2448 (2006).
  21. Cai, D., Chen, S., Glanzman, D. L. Postsynaptic regulation of long-term facilitation in Aplysia. Curr. Biol. 18, 920-925 (2008).
  22. Ho, V. M., Lee, J. A., Martin, K. C. The cell biology of synaptic plasticity. Science. 334, 623-628 (2011).
  23. Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses. Science. 294, 1030-1038 (2001).
  24. Wan, Q., Abrams, T. W. Trans-synaptic plasticity: presynaptic initiation, postsynaptic memory. Curr. Biol. 18, 220-223 (2008).
  25. Bao, J. X., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. Involvement of presynaptic and postsynaptic mechanisms in a cellular analog of classical conditioning at Aplysia sensory-motor neuron synapses in isolated cell culture. J. Neurosci. 18, 458-466 (1998).
  26. Lorenzetti, F. D., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Classical conditioning analog enhanced acetylcholine responses but reduced excitability of an identified neuron. J. Neurosci. 31, 14789-14793 (2011).
  27. Martin, K. C., et al. Synapse-Specific, Long-Term Facilitation of Aplysia Sensory to Motor Synapses: A Function for Local Protein Synthesis in Memory Storage. Cell. 91, 927-938 (1997).
  28. Montarolo, P. G., et al. A critical period for macromolecular synthesis in long-term heterosynaptic facilitation in Aplysia. Science. 234, 1249-1254 (1986).
  29. Mozzachiodi, R., Lorenzetti, F. D., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Changes in neuronal excitability serve as a mechanism of long-term memory for operant conditioning. Nat. Neurosci. 11, 1146-1148 (2008).
  30. Alevizos, A., Weiss, K. R., Koester, J. Synaptic actions of identified peptidergic neuron R15 in Aplysia. I. Activation of respiratory pumping. J. Neurosci. 11, 1263-1274 (1991).
  31. Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome. Res. 6, 986-994 (1996).
  32. Moroz, L. L., et al. Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry. Cell. 127, 1453-1467 (2006).
  33. Moroz, L. L., Kohn, A. B. Do different neurons age differently? Direct genome-wide analysis of aging in single identified cholinergic neurons. Front. Aging Neurosci. 2, (2010).
  34. Kadakkuzha, B. M., Puthanveettil, S. V. Genomics and proteomics in solving brain complexity. Mol. BioSyst. , (2013).
  35. Clemens, S., Katz, P. S. Identified serotonergic neurons in the Tritonia swim CPG activate both ionotropic and metabotropic receptors. J. Neurophysiol. 85, 476-479 (2001).
  36. Murray, J. A., Hewes, R. S., Willows, A. O. Water-flow sensitive pedal neurons in Tritonia: role in rheotaxis. J. Comp. Physiol. 171, 373-385 (1992).
  37. Katz, P. S., Frost, W. N. Intrinsic neuromodulation in the Tritonia swim CPG: the serotonergic dorsal swim interneurons act presynaptically to enhance transmitter release from interneuron C2. J. Neurosci. 15, 6035-6045 (1995).
  38. Brown, G. D., Frost, W. N., Getting, P. A. Habituation and iterative enhancement of multiple components of the Tritonia swim response. Behav. Neurosci. 110, 478-485 (1996).
  39. Popescu, I. R., Frost, W. N. Highly dissimilar behaviors mediated by a multifunctional network in the marine mollusk Tritonia diomedea. J. Neurosci. 22, 1985-1993 (2002).
  40. Megalou, E. V., Brandon, C. J., Frost, W. N. Evidence that the swim afferent neurons of tritonia diomedea are glutamatergic. Biol. Bull. 216, 103-112 (2009).
  41. Hill, E. S., Vasireddi, S. K., Bruno, A. M., Wang, J., Frost, W. N. Variable neuronal participation in stereotypic motor programs. PloS one. 7, (2012).
  42. Yeoman, M. S., Patel, B. A., Arundell, M., Parker, K., O’Hare, D. Synapse-specific changes in serotonin signalling contribute to age-related changes in the feeding behaviour of the pond snail. Lymnaea. J. Neurochem. 106, 1699-1709 (2008).
  43. Moroz, L. L., Dahlgren, R. L., Boudko, D., Sweedler, J. V., Lovell, P. Direct single cell determination of nitric oxide synthase related metabolites in identified nitrergic neurons. J. Inorg. Biochem. 99, 929-939 (2005).
  44. Alania, M., Sakharov, D. A., Elliott, C. J. Multilevel inhibition of feeding by a peptidergic pleural interneuron in the mollusc Lymnaea stagnalis. J. Comp. Physiol. 190, 379-390 (2004).
  45. Straub, V. A., Benjamin, P. R. Extrinsic modulation and motor pattern generation in a feeding network: a cellular study. J. Neurosci. 21, 1767-1778 (2001).
  46. Vehovszky, A., Elliott, C. J. The octopamine-containing buccal neurons are a new group of feeding interneurons in the pond snail Lymnaea stagnalis. Acta Biol. Hungarica. 51, 165-176 (2000).
  47. Jansen, R. F., Pieneman, A. W., ter Maat, A. Spontaneous switching between ortho- and antidromic spiking as the normal mode of firing in the cerebral giant neurons of freely behaving Lymnaea stagnalis. J. Neurophysiol. 76, 4206-4209 (1996).
  48. McCrohan, C. R., Benjamin, P. R. Synaptic relationships of the cerebral giant cells with motoneurones in the feeding system of Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 85, 169-186 (1980).
  49. Malyshev, A. Y., Balaban, P. M. Buccal neurons activate ciliary beating in the foregut of the pteropod mollusk Clione limacina. J. Exp. Biol. 212, 2969-2976 (2009).
  50. Ierusalimsky, V. N., Balaban, P. M. Primary sensory neurons containing command neuron peptide constitute a morphologically distinct class of sensory neurons in the terrestrial snail. Cell Tissue Res. 330, 169-177 (2007).
  51. Malyshev, A. Y., Balaban, P. M. Identification of mechanoafferent neurons in terrestrial snail: response properties and synaptic connections. J. Neurophysiol. 87, 2364-2371 (2002).
  52. Balaban, P. M., et al. A single serotonergic modulatory cell can mediate reinforcement in the withdrawal network of the terrestrial snail. Neurobiol. Learn. Mem. 75, 30-50 (2001).
  53. Ierusalimsky, V. N., Zakharov, I. S., Palikhova, T. A., Balaban, P. M. Nervous system and neural maps in gastropod Helix lucorum. 24, 13-22 (1994).
  54. Kharchenko, O. A., Grinkevich, V. V., Vorobiova, O. V., Grinkevich, L. N. Learning-induced lateralized activation of the MAPK/ERK cascade in identified neurons of the food-aversion network in the mollusk Helix lucorum. Neurobiol. Learn. Mem. 94, 158-166 (2010).
  55. Ivanova, J. L., et al. Intracellular localization of the HCS2 gene products in identified snail neurons in vivo and in vitro. Cell. Mol. Neurobiol.. 26, 127-144 (2006).
  56. Kiss, T. Evidence for a persistent Na-conductance in identified command neurones of the snail, Helix pomatia. Brain Res. 989, 16-25 (2003).
  57. Balaban, P. M. Cellular mechanisms of behavioral plasticity in terrestrial snail. Neurosci. Biobehav. Rev. 26, 597-630 (2002).

Tags

Keywords: Aplysia GangliaElectrophysiologyMolecular AnalysisSingle NeuronNeural Circuitry행동분석학ProteaseGene ExpressionCREB1L7R15L11R2
check_url/kr/51075?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Akhmedov, K., Kadakkuzha, B. M., Puthanveettil, S. V. Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons. J. Vis. Exp. (83), e51075, doi:10.3791/51075 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image