JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생체공학

אקליפסיה (1991) הכנת גנגליה לניתוחים אלקטרופיזיולוגיים ומולקולריים של נוירונים בודדים

Published: January 13, 2014
doi:
10.3791/51075
, ,
1Department of Neuroscience,The Scripps Research Institute, Florida

Summary

חילזון ימי Aplysia californica כבר בשימוש נרחב כמודל נוירוביולוגיה למחקרים על בסיס תאי ומולקולרי של התנהגות. כאן מתוארת מתודולוגיה לחקר מערכת העצבים של Aplysia לניתוחים אלקטרופיזיולוגיים ומולקולריים של נוירונים בודדים של מעגלים עצביים מזוהים.

Abstract

אתגר מרכזי בנוירוביולוגיה הוא להבין את היסודות המולקולריים של מעגלים עצביים השולטים בהתנהגות מסוימת. לאחר זיהוי המנגנונים המולקולריים הספציפיים, ניתן לפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשות לטיפול במומים בהתנהגויות ספציפיות הנגרמות על ידי מחלות ניווניות או הזדקנות מערכת העצבים. חילזון ימי Aplysia californica מתאים היטב לחקירות של בסיס תאי ומולקולרי של התנהגות כי מעגלים עצביים שבבסיס התנהגות מסוימת ניתן לקבוע בקלות את המרכיבים הבודדים של המעגלים יכולים להיות מניפולציה בקלות. יתרונות אלה של Aplysia הובילו למספר תגליות בסיסיות של נוירוביולוגיה של למידה וזיכרון. כאן אנו מתארים הכנה של מערכת העצבים Aplysia לניתוחים אלקטרופיזיולוגיים ומולקולריים של נוירונים בודדים. בקצרה, גנגליון מנותח ממערכת העצבים נחשף פרוטאז כדי להסיר את נדן גנגליון כך נוירונים נחשפים אבל לשמור על פעילות עצבית כמו החיה שלם. הכנה זו משמשת לביצוע מדידות אלקטרופיזיולוגיות של נוירונים בודדים או מרובים. חשוב לציין, בעקבות ההקלטה באמצעות מתודולוגיה פשוטה, הנוירונים יכולים להיות מבודדים ישירות מן הגרעינים לניתוח ביטוי גנים. פרוטוקולים אלה שימשו לביצוע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות בו זמנית של נוירונים L7 ו- R15, ללמוד את תגובתם אצטילכולין וביטוי כמותי של גן CREB1 מבודד יחיד L7, L11, R15, ו R2 נוירונים של Aplysia.

Introduction

המוח האנושי מורכב בצורה יוצאת דופן עם כמעט 100 מיליארד נוירונים וטריליוני קשרים סינפטיים. ישנם מספר כמעט שווה של תאים nonneuronal כי אינטראקציה עם נוירונים לווסת את תפקידם במוח. נוירונים מאורגנים במעגלים המווסתים התנהגויות ספציפיות. למרות ההתקדמות בהבנתנו את תפקודי המוח והמעגלים העצביים, מעט מאוד ידוע על זהותם של מרכיבי מעגלים השולטים בהתנהגות מסוימת. ידע בזהויות של מרכיבים שונים של מעגלים יקל מאוד על הבנתנו הן של הבסיס התאי והן של הבסיס המולקולרי של התנהגות וסיוע בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשניות להפרעות נוירופסיכיאטריות.

חילזון ימי Aplysia californica כבר סוס עבודה לקביעת מעגלים עצביים ביסוד התנהגויות ספציפיות1-14. מערכת העצבים Aplysia מכיל כ 20,000 נוירונים המאורגנים לתוך 9 גרעינים שונים. הנוירונים של Aplysia הם גדולים וניתן לזהות בקלות על סמך גודלם, תכונות חשמליות, ואת המיקום הגרעיני. Aplysia יש רפרטואר עשיר של התנהגויות שניתן ללמוד. אחת ההתנהגויות הנחקרות היטב היא רפלקס משיכת הזימים (GWR). המרכיבים העיקריים של רפלקס זה ממוקמים גרעיני בטן. רכיבים של מעגלי GWR מופו ותרומות של רכיבים שונים נקבעו. חשוב לציין, מעגלי GWR עוברים למידה אסוציאטיבית ולא אסוציאטיבית5,6,15-19. עשרות שנים של מחקר על רפלקס זה זיהו גם כמה מסלולי איתות שיש להם תפקיד מפתח בלמידה וזיכרון20-24.

מספר תכשירים שונים של Aplysia שימשו כדי ללמוד בסיס תאי ומולקולרי של אחסון זיכרון. אלה כוללים את החיה שלם2,3, הכנה שלם למחצה1,7,13,14,16 ו reconstitution של מרכיבים עיקריים של מעגלים עצביים25-29. הכנה מופחתת לחקר הגרעינים Aplysia עבור ניתוחים אלקטרופיזיולוגיים ומולקולריים של מעגלים עצביים מזוהים מתואר כאן. ארבעת הנוירונים הבאים שזוהו נחקרו. R15, נוירון מתפרץ, L7 ו L11, שני נוירונים מוטוריים שונים R2, נוירון שימוש נחקרו. R2 הוא הנוירון הגדול ביותר המתואר במערכת העצבים חסרי החוליות. בקצרה, מתודולוגיה זו כוללת טיפול פרוטאז של גרעינים, מדידות אלקטרופיזיולוגיות לפני ואחרי טיפולים תרופתיים, ובידוד של נוירונים בודדים לניתוח כמותי של ביטוי גנים. מתודולוגיה זו מאפשרת לנו לשלב ניתוחים מולקולריים עם הקלטה בו זמנית של נוירונים מרובים. מתודולוגיה זו שימשה בהצלחה כדי ללמוד את התגובות של נוירונים R15 ו L7 אצטילכולין (Ach) על ידי זיווג הקלטות תאיים. בעקבות מדידות אלקטרופיזיולוגיות R15 ו- L7 ותאי עצב מזוהים אחרים כגון L11 ו- R2 בודדו לניתוח תגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR) של ביטוי CREB1, גורם שעתוק חשוב לאחסון זיכרון.

Protocol

1. הכנת גנגליה בטן, מדידות אלקטרופיזיולוגיות, ובידוד של נוירונים בודדים שזוהו מגנגליון הבטן של Aplysia californica שמור על Aplysia באקווריום המעבדה עם מי ים מלאכותיים במחזור (ASW) ב 16 °C (60 °F) תחת 12:12 אור:תנאים כהים. בידוד של גנגליון בטן. הרדמה בעלי חיים על ידי הזרקת 380 mM MgCl2 פתר…

Representative Results

משקלם של בעלי החיים ששימשו במחקר זה נע בין 100-200 גרם. בעקבות הפרוטוקולים המתוארים, ערכנו מדידות אלקטרופיזיולוגיות וניתוח מולקולרי של נוירונים של גרעיני בטן מבודדים מבעלי חיים הנעים בין 2-5 גרם ל -200-300 גרם. סטנדרטיזציה של טיפול פרוטאז חשוב למדידות אלקטרופיזיולוגיות מוצלחות של …

Discussion

הנוירון R15 מעורב בוויסות מערכות לב וכלי דם, עיכול, נשימה ורבייה30. פעילות מתפוצצת קצבית באופן קבוע של AP היא תכונה של R15. כפי שמוצג בסעיף התוצאות, הקלטה מזווגת של R15 ו- L7 מראה כי הכנת הגרעינים שמרה על פעילות של נוירונים R15. נוירונים R15 ו- L7 הגיבו כראוי לאח. הכנה גרעינית זו יכולה להישמר עד 8-10 ש?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים מעומק הלב לקרן וייטהול על תמיכתם במימון וקרנות הסטארט-אפ ממכון המחקר סקריפס על ביצוע עבודה זו.

Materials

Aplysia National Aplysia Resource Facility, University of Miami
NaCl SIGMA S 3014-1KG
KCl SIGMA P 9333-500G
CaCl2•2H2O SIGMA C5080- 500G
MgCl2•6H2O Fisher Scientific BP 214-501
NaHCO4 SIGMA S 6297-250G
HEPES SIGMA H 3375-500G
Protease GIBCO 17105-042
Trizol Ambion 15596-026
Chloroform MP Biomedicals 2194002
100% Ethanol ACROS 64-17-5
GlycoBlue Ambion AM9515
3 M NaOAc, pH 5.5 Ambion AM9740
Nuclease free water Ambion AM9737
MessageAmp II aRNA Amplification Kit Ambion AM1751
qScript cDNA SuperMix Quanta Biosciences 95048-100
Power SYBR Green PCR Master Mix Applied Biosystems 4367659
Forceps Fine Science Tools 11252-20
Scissors Fine Science Tools 15000-08
Stainless Steel Minutien Pins  Fine Science Tools 26002-10 or
26002-20
Veriti Thermal Cycler Applied Biosystems Veriti Thermal Cycler
5430R Centrifuge Eppendorf 5430R Centrifuge
7900HT Fast Real-Time PCR Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR
Amplifier BRAMP-01R NPI Electronics
Digidata Converter Instrutech ITC-18 HEKA ELEKTRONIK
Micro Manipulator Patch Star Scientifica
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cleary, L. J., Byrne, J. H., Frost, W. N. Role of interneurons in defensive withdrawal reflexes in Aplysia. Learn. Mem. 2, 133-151 (1995).
  2. Elliott, C. J., Susswein, A. J. Comparative neuroethology of feeding control in molluscs. The J. Exp. Biol. 205, 877-896 (2002).
  3. Nargeot, R., Simmers, J. Functional organization and adaptability of a decision-making network in Aplysia. Front. Neurosci. 6, 113 (2012).
  4. Baxter, D. A., Byrne, J. H. Feeding behavior of Aplysia: a model system for comparing cellular mechanisms of classical and operant conditioning. Learn. Mem. 13, 669-680 (2006).
  5. Castellucci, V., Pinsker, H., Kupfermann, I., Kandel, E. R. Neuronal mechanisms of habituation and dishabituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Science. 167, 1745-1748 (1970).
  6. Castellucci, V. F., Carew, T. J., Kandel, E. R. Cellular analysis of long-term habituation of the gill-withdrawal reflex of Aplysia californica. Science. 202, 1306-1308 (1978).
  7. Dembrow, N. C., et al. A newly identified buccal interneuron initiates and modulates feeding motor programs in Aplysia. J. Neurophysiol. 90, 2190-2204 (2003).
  8. Fredman, S. M., Jahan-Parwar, B. Command neurons for locomotion in Aplysia. J. Neurophysiol. 49, 1092-1117 (1983).
  9. Jing, J., Vilim, F. S., Cropper, E. C., Weiss, K. R. Neural analog of arousal: persistent conditional activation of a feeding modulator by serotonergic initiators of locomotion. J. Neurosci. 28, 12349-12361 (2008).
  10. McManus, J. M., Lu, H., Chiel, H. J. An in vitro preparation for eliciting and recording feeding motor programs with physiological movements in Aplysia californica. J. Vis. Exp. (4320), (2012).
  11. McPherson, D. R., Blankenship, J. E. Neuronal modulation of foot and body-wall contractions in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 67, 23-28 (1992).
  12. Miller, N., Saada, R., Fishman, S., Hurwitz, I., Susswein, A. J. Neurons controlling Aplysia feeding inhibit themselves by continuous NO production. PloS one. 6, (2011).
  13. Perrins, R., Weiss, K. R. A cerebral central pattern generator in Aplysia and its connections with buccal feeding circuitry. J. Neurosci. 16, 7030-7045 (1996).
  14. Xin, Y., Weiss, K. R., Kupfermann, I. An identified interneuron contributes to aspects of six different behaviors in Aplysia. J. Neurosci. 16, 5266-5279 (1996).
  15. Carew, T. J., Castellucci, V. F., Byrne, J. H., Kandel, E. R. Quantitative analysis of relative contribution of central and peripheral neurons to gill-withdrawal reflex in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 42, 497-509 (1979).
  16. Cohen, T. E., Kaplan, S. W., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. A simplified preparation for relating cellular events to behavior: mechanisms contributing to habituation, dishabituation, and sensitization of the Aplysia gill-withdrawal reflex. J. Neurosci. 17, 2886-2899 (1997).
  17. Frost, L., et al. A simplified preparation for relating cellular events to behavior: contribution of LE and unidentified siphon sensory neurons to mediation and habituation of the Aplysia gill- and siphon-withdrawal reflex. J. Neurosci. 17, 2900-2913 (1997).
  18. Frost, W. N., Castellucci, V. F., Hawkins, R. D., Kandel, E. R. Monosynaptic connections made by the sensory neurons of the gill- and siphon-withdrawal reflex in Aplysia participate in the storage of long-term memory for sensitization. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8266-8269 (1985).
  19. Hawkins, R. D., Greene, W., Kandel, E. R. Classical conditioning, differential conditioning, and second-order conditioning of the Aplysia gill-withdrawal reflex in a simplified mantle organ preparation. Behav. Neurosci. 112, 636-645 (1998).
  20. Hawkins, R. D., Clark, G. A., Kandel, E. R. Operant conditioning of gill withdrawal in Aplysia. J. Neurosci. 26, 2443-2448 (2006).
  21. Cai, D., Chen, S., Glanzman, D. L. Postsynaptic regulation of long-term facilitation in Aplysia. Curr. Biol. 18, 920-925 (2008).
  22. Ho, V. M., Lee, J. A., Martin, K. C. The cell biology of synaptic plasticity. Science. 334, 623-628 (2011).
  23. Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses. Science. 294, 1030-1038 (2001).
  24. Wan, Q., Abrams, T. W. Trans-synaptic plasticity: presynaptic initiation, postsynaptic memory. Curr. Biol. 18, 220-223 (2008).
  25. Bao, J. X., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. Involvement of presynaptic and postsynaptic mechanisms in a cellular analog of classical conditioning at Aplysia sensory-motor neuron synapses in isolated cell culture. J. Neurosci. 18, 458-466 (1998).
  26. Lorenzetti, F. D., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Classical conditioning analog enhanced acetylcholine responses but reduced excitability of an identified neuron. J. Neurosci. 31, 14789-14793 (2011).
  27. Martin, K. C., et al. Synapse-Specific, Long-Term Facilitation of Aplysia Sensory to Motor Synapses: A Function for Local Protein Synthesis in Memory Storage. Cell. 91, 927-938 (1997).
  28. Montarolo, P. G., et al. A critical period for macromolecular synthesis in long-term heterosynaptic facilitation in Aplysia. Science. 234, 1249-1254 (1986).
  29. Mozzachiodi, R., Lorenzetti, F. D., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Changes in neuronal excitability serve as a mechanism of long-term memory for operant conditioning. Nat. Neurosci. 11, 1146-1148 (2008).
  30. Alevizos, A., Weiss, K. R., Koester, J. Synaptic actions of identified peptidergic neuron R15 in Aplysia. I. Activation of respiratory pumping. J. Neurosci. 11, 1263-1274 (1991).
  31. Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome. Res. 6, 986-994 (1996).
  32. Moroz, L. L., et al. Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry. Cell. 127, 1453-1467 (2006).
  33. Moroz, L. L., Kohn, A. B. Do different neurons age differently? Direct genome-wide analysis of aging in single identified cholinergic neurons. Front. Aging Neurosci. 2, (2010).
  34. Kadakkuzha, B. M., Puthanveettil, S. V. Genomics and proteomics in solving brain complexity. Mol. BioSyst. , (2013).
  35. Clemens, S., Katz, P. S. Identified serotonergic neurons in the Tritonia swim CPG activate both ionotropic and metabotropic receptors. J. Neurophysiol. 85, 476-479 (2001).
  36. Murray, J. A., Hewes, R. S., Willows, A. O. Water-flow sensitive pedal neurons in Tritonia: role in rheotaxis. J. Comp. Physiol. 171, 373-385 (1992).
  37. Katz, P. S., Frost, W. N. Intrinsic neuromodulation in the Tritonia swim CPG: the serotonergic dorsal swim interneurons act presynaptically to enhance transmitter release from interneuron C2. J. Neurosci. 15, 6035-6045 (1995).
  38. Brown, G. D., Frost, W. N., Getting, P. A. Habituation and iterative enhancement of multiple components of the Tritonia swim response. Behav. Neurosci. 110, 478-485 (1996).
  39. Popescu, I. R., Frost, W. N. Highly dissimilar behaviors mediated by a multifunctional network in the marine mollusk Tritonia diomedea. J. Neurosci. 22, 1985-1993 (2002).
  40. Megalou, E. V., Brandon, C. J., Frost, W. N. Evidence that the swim afferent neurons of tritonia diomedea are glutamatergic. Biol. Bull. 216, 103-112 (2009).
  41. Hill, E. S., Vasireddi, S. K., Bruno, A. M., Wang, J., Frost, W. N. Variable neuronal participation in stereotypic motor programs. PloS one. 7, (2012).
  42. Yeoman, M. S., Patel, B. A., Arundell, M., Parker, K., O’Hare, D. Synapse-specific changes in serotonin signalling contribute to age-related changes in the feeding behaviour of the pond snail. Lymnaea. J. Neurochem. 106, 1699-1709 (2008).
  43. Moroz, L. L., Dahlgren, R. L., Boudko, D., Sweedler, J. V., Lovell, P. Direct single cell determination of nitric oxide synthase related metabolites in identified nitrergic neurons. J. Inorg. Biochem. 99, 929-939 (2005).
  44. Alania, M., Sakharov, D. A., Elliott, C. J. Multilevel inhibition of feeding by a peptidergic pleural interneuron in the mollusc Lymnaea stagnalis. J. Comp. Physiol. 190, 379-390 (2004).
  45. Straub, V. A., Benjamin, P. R. Extrinsic modulation and motor pattern generation in a feeding network: a cellular study. J. Neurosci. 21, 1767-1778 (2001).
  46. Vehovszky, A., Elliott, C. J. The octopamine-containing buccal neurons are a new group of feeding interneurons in the pond snail Lymnaea stagnalis. Acta Biol. Hungarica. 51, 165-176 (2000).
  47. Jansen, R. F., Pieneman, A. W., ter Maat, A. Spontaneous switching between ortho- and antidromic spiking as the normal mode of firing in the cerebral giant neurons of freely behaving Lymnaea stagnalis. J. Neurophysiol. 76, 4206-4209 (1996).
  48. McCrohan, C. R., Benjamin, P. R. Synaptic relationships of the cerebral giant cells with motoneurones in the feeding system of Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 85, 169-186 (1980).
  49. Malyshev, A. Y., Balaban, P. M. Buccal neurons activate ciliary beating in the foregut of the pteropod mollusk Clione limacina. J. Exp. Biol. 212, 2969-2976 (2009).
  50. Ierusalimsky, V. N., Balaban, P. M. Primary sensory neurons containing command neuron peptide constitute a morphologically distinct class of sensory neurons in the terrestrial snail. Cell Tissue Res. 330, 169-177 (2007).
  51. Malyshev, A. Y., Balaban, P. M. Identification of mechanoafferent neurons in terrestrial snail: response properties and synaptic connections. J. Neurophysiol. 87, 2364-2371 (2002).
  52. Balaban, P. M., et al. A single serotonergic modulatory cell can mediate reinforcement in the withdrawal network of the terrestrial snail. Neurobiol. Learn. Mem. 75, 30-50 (2001).
  53. Ierusalimsky, V. N., Zakharov, I. S., Palikhova, T. A., Balaban, P. M. Nervous system and neural maps in gastropod Helix lucorum. 24, 13-22 (1994).
  54. Kharchenko, O. A., Grinkevich, V. V., Vorobiova, O. V., Grinkevich, L. N. Learning-induced lateralized activation of the MAPK/ERK cascade in identified neurons of the food-aversion network in the mollusk Helix lucorum. Neurobiol. Learn. Mem. 94, 158-166 (2010).
  55. Ivanova, J. L., et al. Intracellular localization of the HCS2 gene products in identified snail neurons in vivo and in vitro. Cell. Mol. Neurobiol.. 26, 127-144 (2006).
  56. Kiss, T. Evidence for a persistent Na-conductance in identified command neurones of the snail, Helix pomatia. Brain Res. 989, 16-25 (2003).
  57. Balaban, P. M. Cellular mechanisms of behavioral plasticity in terrestrial snail. Neurosci. Biobehav. Rev. 26, 597-630 (2002).

Tags

Keywords: Aplysia GangliaElectrophysiologyMolecular AnalysisSingle NeuronNeural Circuitry행동분석학ProteaseGene ExpressionCREB1L7R15L11R2
check_url/kr/51075?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Akhmedov, K., Kadakkuzha, B. M., Puthanveettil, S. V. Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons. J. Vis. Exp. (83), e51075, doi:10.3791/51075 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image