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생체공학

アプリジア 単一ニューロンの電気生理学的・分子的解析のための神経節の準備

Published: January 13, 2014
doi:
10.3791/51075
, ,
1Department of Neuroscience,The Scripps Research Institute, Florida

Summary

海洋カタツムリ のアプリシアカリフォルニカ は、細胞および分子ベースの行動に関する研究のための神経生物学モデルとして広く使用されている。ここでは、同定された神経回路の単一ニューロンの電気生理学的および分子的分析のための Aplysia の神経系を探索するための方法論が記載されている。

Abstract

神経生物学における大きな課題は、特定の行動を支配する神経回路の分子基盤を理解することです。特定の分子機構が特定されると、変性疾患や神経系の老化によって引き起こされる特定の行動の異常を治療するための新しい治療戦略を開発することができます。海洋カタツムリ のAplysiaカリフォルニカ は、特定の行動の根底にある神経回路を容易に決定することができ、回路の個々の構成要素を容易に操作できるため、細胞および分子ベースの行動の調査に適しています。 Aplysia のこれらの利点は、学習と記憶の神経生物学のいくつかの基本的な発見につながっています。.ここでは、個々のニューロンの電気生理学的および分子的分析のための Aplysia 神経系の調製について説明する。簡単に言えば、神経系から解剖された神経節は、ニューロンが露出されるが、無傷の動物のように神経細胞活動を保持するように神経節鞘を除去するためにプロテアーゼにさらされる。この調製物は、単一または複数のニューロンの電気生理学的測定を行うために使用される。重要なことに、単純な方法論を用いた記録に続いて、ニューロンは遺伝子発現解析のために神経節から直接単離されることができた。これらのプロトコルは、L7およびR15ニューロンからの同時電気生理学的記録を行い、アセチルコリンに対する応答を研究し 、APlysiaの単一の単一のL7、L11、R15、およびR2ニューロンにおけるCREB1遺伝子の定量発現を研究するために使用された。

Introduction

人間の脳は、ほぼ1000億個のニューロンと何兆ものシナプス接続を持つ非常に複雑です。ニューロンと相互作用し、脳内の機能を調節する非神経細胞のほぼ同じ数があります。.ニューロンは、特定の動作を調節する回路に編成されています。脳機能や神経回路の理解が進んでいますが、特定の行動を制御する回路コンポーネントのアイデンティティについてはほとんど知られていません。回路の様々な構成要素のアイデンティティの知識は、細胞と分子の行動の両方の理解を大幅に促進し、神経精神疾患の新しい治療戦略を開発するのに役立ちます。

海洋カタツムリのAplysiaカリフォルニカは、特定の行動の基礎となる神経回路を決定するための主力となっています1-14.Aplysia神経系には、9つの異なる神経節に編成された約20,000個のニューロンが含まれています。Aplysiaのニューロンは大きく、その大きさ、電気的特性、および神経節内の位置に基づいて容易に識別することができる。Aplysiaは、研究することができる行動の豊富なレパートリーを持っています。よく研究された行動の一つは、ギル離脱反射(GWR)です。この反射の中心成分は腹部神経節に位置する。GWR回路のコンポーネントがマッピングされ、さまざまな成分の寄与が決定されました。重要なことに、GWR回路は、自動調整および非関連の学習を受ける5,6,15-19.この反射に関する数十年にわたる研究はまた、学習と記憶20-24において重要な役割を持ついくつかのシグナル伝達経路を同定した。

Aplysiaのいくつかの異なる調製物は、記憶記憶の細胞および分子ベースを研究するために使用された。これらには、無傷の動物2,3、半無傷の調製1,7,13,14,16および神経回路25-29の主要成分の再構成が含まれる。同定された神経回路の電気生理学的および分子的分析のためのAplysia神経節を探索するための還元された準備をここに説明する。次の4つの同定されたニューロンが研究された。R15は、バーストニューロン、L7およびL11、2つの異なる運動ニューロンとR2、コリン作動性ニューロンを研究した。R2は無脊椎動物神経系に記載されている最大のニューロンである。簡単に言えば、この方法論は、神経節のプロテアーゼ治療、薬理学的治療の前後の電気生理学的測定、および遺伝子発現の定量的分析のための単一ニューロンの単一のニューロンの単一の分離を含む。この方法論により、分子解析と複数のニューロンからの同時記録を組み合わせるようになっています。この方法論は、細胞内の記録を組み合わせてアセチルコリン(Ach)に対するR15およびL7ニューロンの応答を研究するために成功して使用されました。電気生理学的測定R15およびL7およびL11およびR2のような他の同定されたニューロンは、CREB1の発現の定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)分析のために単離された、記憶記憶に重要な転写因子である。

Protocol

1. 腹部神経節の調製、電気生理学的測定、および単一同定ニューロンの単一同定された神経節の分離 12:12光:暗い条件下で16 °Cで循環人工海水(ASW)と実験室の水槽で Aplysia を維持します。 腹部神経節の隔離。 5-10分間(動物の体重の30〜35%に相当)のために380 mM MgCl2 溶液を注入することによって動物を麻酔します。 中枢神経系24,28におけ?…

Representative Results

この研究で使用された動物の重量は100〜200gの範囲であった。記載されたプロトコルに従い、2-5gから200〜300gの範囲の動物から分離された腹部神経節のニューロンの電気生理学的測定および分子解析を行った。 プロテアーゼ処理の標準化は、神経節におけるニューロンの電気生理学的測定を成功させるために重要である。当初、複数のプロテアーゼ(Dispase)濃度および持続?…

Discussion

ニューロンR15は、心血管、消化器、呼吸器、および生殖システム30の調節に関与している。AP の定期的なリズミカルなバースト活動は、R15 の機能です。結果セクションに示すように、R15とL7の対の記録は、神経節調製がR15ニューロンの活性を保持していることを示す。R15およびL7ニューロンはAchに適切に反応した。この神経節製剤は8〜10時間まで維持することができ、電気生理学的活?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ホワイトホール財団は、この作業を行ったスクリプス研究所からの資金援助とスタートアップ資金に心から感謝します。

Materials

Aplysia National Aplysia Resource Facility, University of Miami
NaCl SIGMA S 3014-1KG
KCl SIGMA P 9333-500G
CaCl2•2H2O SIGMA C5080- 500G
MgCl2•6H2O Fisher Scientific BP 214-501
NaHCO4 SIGMA S 6297-250G
HEPES SIGMA H 3375-500G
Protease GIBCO 17105-042
Trizol Ambion 15596-026
Chloroform MP Biomedicals 2194002
100% Ethanol ACROS 64-17-5
GlycoBlue Ambion AM9515
3 M NaOAc, pH 5.5 Ambion AM9740
Nuclease free water Ambion AM9737
MessageAmp II aRNA Amplification Kit Ambion AM1751
qScript cDNA SuperMix Quanta Biosciences 95048-100
Power SYBR Green PCR Master Mix Applied Biosystems 4367659
Forceps Fine Science Tools 11252-20
Scissors Fine Science Tools 15000-08
Stainless Steel Minutien Pins  Fine Science Tools 26002-10 or
26002-20
Veriti Thermal Cycler Applied Biosystems Veriti Thermal Cycler
5430R Centrifuge Eppendorf 5430R Centrifuge
7900HT Fast Real-Time PCR Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR
Amplifier BRAMP-01R NPI Electronics
Digidata Converter Instrutech ITC-18 HEKA ELEKTRONIK
Micro Manipulator Patch Star Scientifica
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Keywords: Aplysia GangliaElectrophysiologyMolecular AnalysisSingle NeuronNeural Circuitry행동분석학ProteaseGene ExpressionCREB1L7R15L11R2
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Akhmedov, K., Kadakkuzha, B. M., Puthanveettil, S. V. Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons. J. Vis. Exp. (83), e51075, doi:10.3791/51075 (2014).
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