Préparation du primaire Myogenic précurseurs cellulaires / cultures de myoblastes de basales vertébrés lignées

Summary

La culture in vitro systèmes ont prouvé indispensable à notre compréhension de la myogenèse des vertébrés. Cependant, il reste beaucoup à apprendre sur le développement du muscle squelettique non-mammifère et la croissance, en particulier dans les taxons de base. Un protocole efficace et robuste pour isoler les cellules souches adultes de ce tissu, les cellules précurseurs myogéniques (PPM), et de maintenir leur auto-renouvellement, la prolifération et la différenciation dans un contexte de culture primaire permet d'identifier des mécanismes de régulation conservés et divergentes tout au long de les lignées de vertébrés.

Abstract

En raison de la difficulté et le temps inhérente d'étudier le programme myogénique in vivo, les systèmes de culture primaire dérivées des cellules souches adultes résidents du muscle squelettique, les cellules précurseurs myogéniques (PPM), se sont révélés indispensables à notre compréhension du développement du muscle squelettique de mammifère et croissance. En particulier chez les taxons de base de vertébrés, cependant, les données sont limitées décrivant les mécanismes moléculaires qui contrôlent l'auto-renouvellement, la prolifération et la différenciation des PPM. D'intérêt particulier sont les mécanismes potentiels qui sous-tendent la capacité des vertébrés basales de subir postlarvaire hyperplasie des fibres musculaires squelettiques considérable (c. téléostéens de poisson) et la régénération complète suite à la perte appendice (c. urodèles des amphibiens). En outre, l'utilisation de myoblastes en culture pourrait aider à la compréhension de la régénération et la réexposition du programme myogénique et les différences entre eux. Àcette fin, nous décrivons en détail un protocole robuste et efficace (et leurs variations) pour isoler et maintenir PPM et leur progéniture, les myoblastes et les myotubes immatures, en culture cellulaire comme une plate-forme pour la compréhension de l'évolution du programme myogénique, en commençant par le plus vertébrés basales. Capitalisant sur ​​le modèle du statu organisme du poisson zèbre (Danio rerio), nous présentons l'application de ce protocole aux petits poissons de la cyprinidés clade Danioninae. Parallèlement, ce protocole peut être utilisé pour réaliser une approche comparative plus large en isolant PPM de l'axolotl mexicain (Ambystomamexicanum) et même les rongeurs de laboratoire. Ce protocole est maintenant largement utilisée dans l'étude de la myogenèse dans plusieurs espèces de poissons, y compris la truite arc, le saumon et la dorade ^1-4.

Introduction

Une bonne compréhension de la myogenèse mammifère a été obtenue par la récapitulation de ce processus dans les deux souris primaire (Mus musculus) cultures de myoblastes et la lignée cellulaire dérivée de la souris bien décrit, C2C12 ^5. Début dans les années 1950 ^6, ces cultures ont conduit à beaucoup de progrès dans la compréhension du programme murinemyogenic et, par extension, la myogenèse chez les autres vertébrés. En outre, les techniques myofiber d'explants cellulaires unique ont augmenté sur la compréhension des interactions entre les cellules satellites et les fibres musculaires entourant ^7-9. Cultures de cellules sont particulièrement attrayants pour les enquêtes de la myogenèse en raison de la courte période de précurseur de cellule différenciée ^10, relative facilité de transfection pour ARNi ^{11-14, 15,16} transgénique et surexpression études ^14,17,18, l'expansion in vitro suivie d'une greffe in vivo ^18-20, et même échantillonarison de cellules précurseurs myogéniques et leurs agents de régulation entre des taxons ^21,22. Bien que les différences dues à l'environnement artificiel du système de culture ont été décrits ^5,23, ces systèmes in vitro se sont révélés être indispensable à notre dissection du programme complexe qui régit la formation des multinucléées, myofibersfrom mononucléées différenciation terminale des cellules progénitrices prolifératives appelées myosatellite cellules (CSM) chez les mammifères.

En dehors de la classe des mammifères, cependant, la conservation et / ou la divergence des mécanismes contrôlant la myogenèse sont mal comprises, en grande partie en raison de la difficulté de culture de cellules précurseurs myogéniques (PPM) et les myoblastes de divers taxons. En effet, les cultures de myoblastes primaires n'ont été décrit dans trois oiseaux ^24-26, un reptile ^27, quelques amphibiens ^28-30, et quelques poissons ^1,3,4,31-33. Continue lignées cellulaires myogéniques de vertebrates autres que les rongeurs ^34-36 sont encore plus rares, avec la seule ligne non mammifère myogénique cellule étant dérivé de la caille japonaise (Cortunix japonica), QM7 ^37. Malgré de nombreuses tentatives de immortalisation, une lignée de cellules myogéniques téléostéens reste insaisissable et un protocole pour la transfection efficace de ces cellules n'a été publié cette année ^15. Ainsi, des protocoles clairs et bien optimisés pour la culture PPM primaires et les myoblastes d'une variété de vertébrés sont très nécessaires non seulement pour étendre notre connaissance de l'évolution du programme myogénique, mais d'utiliser la puissance de la physiologie comparée de faire des percées dans le traitement des maladies musculo-squelettiques et des troubles humains.

Alors que la littérature contient de nombreux rapports de MPC / myoblastes isolement ^38-49, il est fréquent que les auteurs décrivent les protocoles de ces isolements en bref, souvent incomplètes, les formats. En outre, les protocoles les plus instructifs pensINDIQ U EES ont été développés pour les souris ^50-53, et certains d'entre eux compter sur la sélection d'anticorps ^54,55 ou ^56,57 transgènes de fluorescence, ce qui rend ces protocoles inutilisable ou espèces non-rongeurs intimes impraticables utilisés par les biologistes musculaires. Avec peu connu sur piscine, amphibiens et reptiles myogenèse, un protocole détaillé et complet, décrit avec l'aide de l'audiovisuel et à l'efficacité démontrée dans les espèces apparentées de loin, serait plus utile sur le terrain.

D'abord décrite par Powell et ses collègues en 1989 ^58, le protocole suivant a été initialement développé pour isoler les PPM et les myoblastes de salmonidés (à savoir, la truite arc, Oncorhynchus mykiss, et le saumon de l'Atlantique, Salmo salar) et des cyprinidés plus grands (c.-à-poisson rouge, Carassiusauratusauratus) . En 2000, Fauconneau et Paboeuf optimisés une culture primaire de myoblastes pour la truite arc ^59, et ma minoroptimizationsde ce protocole utilisable dans plusieurs petits ménés du clade Danioninae (de poisson zèbre, Danio rerio, et danio géant, Devario aequipinnatus) ³² en raison des nombreux outils génétiques disponibles pour travailler le poisson zèbre et donc ses proches parents. poissons téléostéens sont des organismes intéressants pour l'étude en raison de leur stratégie de croissance divergent (au moins dans la plupart des espèces). Grands salmonidés, comme la plupart des poissons, poussent pour une durée indéterminée, avec un potentiel de croissance sans entrave par une asymptote à l'échéance, même dans les vieux ^60-62 ans. Contrairement poisson zèbre, les grandes danionins comme le danio géant ⁶³ et moustachus potentiels typiques de poissons téléostéens de croissance d'affichage de danio, rendant leur juxtaposition directe une plate-forme idéale pour comprendre si le choix du destin cellulaire MPC joue un rôle dans l'hyperplasie du muscle squelettique par rapport à l'hypertrophie.

De même, nous avons montré que ce protocole peut être utilisé avec la souris et l'axolotl, avec un rendement de cellule relativement élevé et Viabindices ilité. Salamandres urodèles, comme l'axolotl mexicain (Ambystomamexicanum), possèdent la capacité remarquable à régénérer les tissus, y compris les membres et la queue ^64-66 entières. Cette caractéristique rend ces modèles amphibies intéressants de l'atrophie du muscle squelettique et du vieillissement. Selon le protocole décrit ci-dessous, une approche similaire peut être effectuée comme cela a été fait dans de nombreuses espèces de poissons, fournissant un contexte comparatif encore plus large pour de telles études. Comme de nombreux biologistes vraiment apprécier comparatifs, les avancées les plus significatives en biologie fondamentale et translationnelle biomédecine peuvent être faites lorsque les données sont analysées dans le spectre le plus large (ici, l'ensemble de la lignée des vertébrés).

Protocol

Déclaration éthique: Tout l'expérimentation sur les animaux vertébrés décrites ici a été approuvée à l'avance par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université de l'Alabama à Birmingham et est conforme aux lignes directrices établies par le Bureau de la protection des animaux de laboratoire, National Institutes of Health des États-Unis ministère de la Santé et des Services sociaux. 1. Préparation de la Culture…

Representative Results

Vingt-quatre heures après l'ensemencement, les cellules précurseurs myogéniques (PPM) doivent être visibles fixé au substrat de laminine (voir les figures 1a et 1d). Après ensemencement, les cellules (PPM) adoptent une forme de broche-like, indicative de ce type de cellule (figure 1) et sont MyoD1 + (figure 2). En espèces Danio, PPM semblent être plus compact avec des processus bipolaires petites que ne le font les PPM de Oncorh…

Discussion

Le programme myogénique, quelle qu'en soit les espèces examinées, peut être le plus facilement étudiée à travers un système in vitro. En effet, lors de l'isolement, des cellules précurseurs myogéniques (PPM) chez les poissons ou les cellules myosatellite (MSC) chez les mammifères pénètrent facilement ce processus hautement régulé impliquant la prolifération, le retrait du cycle cellulaire et la différenciation terminale des myoblastes et la fusion de ces myoblastes en myotubes naissante…

Materials

			Table 1. Detailed Reagent Information
Reagent	Company (Preferred v. Alternate)	Catalog Number (Preferred v. Alternate)	Quantity per Culture
γ-irradiated poly-L-lysine	Sigma-Aldrich (MP Biomedicals)	P5899 (ICN19454405)	5 mg
DMEM (high glucose)	Sigma-Aldrich (cellgro)	MT-50-003-PB (D7777)	2 L
Laminin	BD Biosciences (Sigma-Aldrich)	CB-40232 (L2020)	1 mg
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)	BP328-500 (S5761)	1.51 g
HEPES (C8H18N2O4S)	Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)	BP310-1 (H6147)	9.53 g
Antibiotic/Antimycotic	Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)	SV3007901 (A5955)	17-20 mL
Gentamicin Sulfate	Lonza (Sigma-Aldrich)	BW17-519Z (G1397)	2-3 mL
Donor Equine Sera	Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)	SH3007403 (H1270)	75 mL
Fetal Bovine Sera	Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)	SH3007103 (F2442)	25 mL
Collagenase (Type IV)	Worthington (Sigma-Aldrich)	LS004189 (C9891)	0.44 g
Trypsin (from Pancreas)	MP Biomedicals (Sigma-Aldrich)	ICN15357125 (T5266)	1 g
			Table 2. Consumables, Tools and Equipment
Consumable	Tools	Equipment
Cell Culture Plates	Forceps (Coarse)	Serological Pipettor
Sterile 50 mL Conical Tubes	Forceps (Fine)	pH Meter
Laboratory Tape	Scalpel Handles	Chilling Incubator (Echotherm)
0.2 μm Vacuum Sterilization Systems	Scalpel Blades (#10, #11)	Laminar Flow Hood
Water-repellant Autoclave Paper	Surgical Scissors	Vacuum Manifold
Serological Pipettes	Glass Petri Dishes	Microosmolality Meter
	12-16 G Cannulas with Luer Locks
			Table 3. Optimized Volumes for Coating Cell Culture Plates
Plate Size	cm^2 per Well	Poly-L-lysine*	Laminin**
6 well	9.5	1.6 mL	1
24 well	1.9	0.32	0.2
48 well	0.95	0.16	0.1
96 well	0.32	0.06	0.03
*0.1 mg/mL concentration	** 0.020 mg/mL concentration
			Table 4. Media for Isolation, Dissociation, and Culture
Reagent	Isolation	Wash	Dissociation	Complete
Base Medium	419.25 mL	395.40 mL	297.00 mL	178.00 mL
PSF*	5.00 mL	4.00 mL	3.00 mL	2.00 mL
Gentamicin Sulfate**	0.75 mL	0.60 mL	–	–
Donor Equine Serum	75.00 mL	–	–	–
Fetal Bovine Serum***	–	–	–	20.00 mL
* PSF: penicillin/streptomycin/fungizone cocktail (100x); ** 50 mg/mL concentration; *** Characterized
			Table 5. Recommended Dilutions and Plating Volumes
Plate Size	cm^2 per Well	Dilution	Plating Volume
6 well	9.5	1.5-2.0×10^6 cells/mL	1 mL
24 well	1.9	1.5-2.0×10^6 cells/mL	250 μL
48 well	0.95	1.5-2.0×10^6 cells/mL	150 μL
96 well	0.32	1.5-2.0×10^6 cells/mL	50-100 μL
			Table 6. Average number of cells per g tissue
Species		Average # cells/g tissue
Danio rerio		6,400,000
Danio dangila		1,783,000
Devario aequipinnatus		1,797,000
Oncorhynchus mykiss		66,800
			Table 7. Recommended Incubation Temperatures
Species		Temperature
Danio/ Devario spp.		26 – 28 °C
Oncorhynchus/Salmo spp.		10* – 18 °C
Ambystoma mexicanum		18°C
* Lower temperatures support lower proliferation rates.