Bazal Omurgalı soylarından İlköğretim andMyogenic Öncü Hücre / Miyoblast Kültürlerinin Hazırlanması

Summary

Vitro kültürü sistemleri omurgalı Miyogenesis anlayışımıza vazgeçilmez kanıtlanmıştır. Ancak, çok özellikle bazal taksa içinde, memeli olmayana iskelet kas gelişimi ve büyüme öğrendi gerekmektedir. Bu doku, kas kaynaklı öncü hücreleri (MPCs) yetişkin kök hücrelerin izole edilmesi ve bir birincil kültür ortamda kendi kendini yenileme, proliferasyon ve farklılaşma korumak için etkili ve güçlü bir protokol boyunca korunmuş ve farklı düzenleyici mekanizmaların tanımlanması için sağlar: omurgalı soy.

Abstract

Nedeniyle in vivo miyojen programı eğitim ile ilgili doğasında zorluk ve zaman, iskelet kasının yerleşik yetişkin kök hücrelerinden elde edilen primer kültür sistemleri, miyojenik öncü hücreler (MPCs), memeli iskelet kas gelişimi anlayışımıza vazgeçilmez kanıtlanmış ve var büyüme. Özellikle OMURGALI bazal takson arasında, ancak, veri kendini yenileme, çoğalmasını ve MPCs farklılaşmasını kontrol eden moleküler mekanizmaları açıklayan sınırlıdır. Özellikle ilgi apendiksinde kaybı (yani urodele amfibi) sonra hatırı sayılır postlarva iskelet miyofiberde oluşan hiperplazi (yani Kemikli balıklar) ve tam rejenerasyon geçmesi bazal omurgalıların yeteneğini altında yatan potansiyel mekanizmaları vardır. Buna ek olarak, kültürlü miyoblastların kullanımı rejenerasyonu ve kas kaynaklı programın tekrarlama ve aralarındaki farklar anlaşılmasına yardımcı olabilir. KarşıBu amaçla, biz detaylı olarak sağlam ve verimli bir protokol tarif (ve varyasyonlar burada) daha ile başlayan, miyojenik programın evrimini anlamak için bir platform olarak hücre kültüründe, MPCs ve döl, miyoblastları ve olgunlaşmamış miyotüpleri izole ve bakımı için bazal omurgalılar. Zebra balığı (Br.rerio) model organizma durumuna Capitalizing, biz sazan dalının Danioninae küçük balıklar, bu protokolün uygulanması hakkında rapor. Paralel olarak, bu protokol Meksika Axolotl (Ambystomamexicanum) ve hatta laboratuar kemirgenlerden MPCs izole edilmesi suretiyle daha geniş bir karşılaştırmalı bir yaklaşım gerçekleştirmek için kullanılabilir. Bu protokol, artık yaygın gökkuşağı alabalık, somon, ve çipura ^1-4 dahil olmak üzere çeşitli balık türleri, Miyogenesis okuyan kullanılmaktadır.

Introduction

Memeli Miyogenesis arasında dikkate değer bir anlayış C2C12 ^5, her iki primer fare (Mus musculus) miyoblast kültürleri ve iyi tanımlanmış bir fare-türevi hücre hattı bu sürecin tekrarlama yoluyla elde edilmiştir. 1950 ⁶ başlayarak, bu kültürler diğer omurgalılarda uzantısı, Miyogenesis ile murinemyogenic programın anlayışında çok ilerleme yol açmış ve var. Buna ek olarak, tek bir hücre miyofiberde oluşan eksplant teknikleri uydu hücreleri ve çevreleyen myofibers ^7-9 arasındaki etkileşimlerin bir anlayış üzerinden artmıştır. Hücre kültürleri edilir Miyogenesis araştırmalar için özellikle çekici dolayı kısa bir süre için ön-farklılaşmış hücre ^10, RNAi için transfeksiyon nispi kolaylığı ^{11-14, 15,16} ve transgenik aşırı ekspresyonu çalışmaları ^14,17,18, in vitro ve in vivo nakli ^18-20 ardından genişleme ve hatta comptakson ^21,22 karşısında miyojenik öncü hücreleri ve bunların düzenleyici ajanlar Arison'ın. Nedeniyle, kültür sisteminin yapay çevreye farkları ^5,23 tarif edilmiş olsa da, bu in vitro sistemler çok çekirdekli oluşumunu düzenleyen karmaşık program eden diseksiyon vazgeçilmez olduğu kanıtlanmıştır, terminal olarak farklılaşmış myofibersfrom myosatellite olarak bilinen çoğalma progenitör hücreler mononükleer memeliler arasında hücreler (MSC).

Memeliler sınıfının dışında, ancak, Miyogenesis kontrol mekanizmalarının korunması ve / veya sapma kötü büyük ölçüde nedeniyle çeşitli takson miyojen öncü hücreleri (MPCs) ve miyoblastları kültüre de zorluk, anlaşılmaktadır. Gerçekten de, birinci miyoblast kültürler üç kuş ^24-26, bir sürüngen ^27, birkaç ^{amfibiler, 28-30} ve bazı balıklar ^1,3,4,31-33 'de tarif edilmiştir. Ettik ikinci sürekli miyojenik hücre çizgilerikemirgenler ^34-36 dışındaki rtebrates Japon bıldırcını (Cortunix japonica) türetilmiş olan tek memeli olmayan miyogenik hücre hattı, QM7 ³⁷ ile daha da nadirdir. Ölümsüzleşme birçok girişimlerine rağmen, bir teleost miyojenik hücre hattı sürüncemede kalır ve bu hücrelerin etkili tarnsfeksiyon için bir protokol, bu yıl sadece ¹⁵ yayınlandı. Böylece, omurgalıların çeşitli birincil MPCs ve miyoblastları kültürleme için açık ve iyi optimize edilmiş protokoller çok daha miyojen programın evrim bilgimizi genişletmek için değil sadece, ama atılımlar yapmak için karşılaştırmalı fizyoloji gücünü istihdam için gerekli insan iskelet kası hastalık ve bozuklukların tedavisi.

Edebiyat MPC / myoblast izolasyon ^38-49 birçok raporlar içerir iken, yazarlar kısa, genellikle eksik, biçimleri gibi izolasyonların protokolleri tanımlamak için yaygındır. Ayrıca, en öğretici protokolleri reported fareler ^50-53 için geliştirilmiştir ve bunlardan bazıları bu protokoller kullanılamaz veya kas biyologlar tarafından kullanılan pratik içteki olmayan kemirgen türü yapma, antikor seçiminde ^54,55 veya floresan transgenler ^56,57 güveniyor. Görsel-işitsel rehberlik ve uzak akraba türlerde gösterdiği verimlilik ile tarif piscine, amfibiyene ve sürüngen Miyogenesis, ayrıntılı ve kapsamlı protokol, hakkında az bilinen ile, alanında en yararlı olacaktır.

Ilk kez 1989 yılında ⁵⁸ Powell ve arkadaşları tarafından açıklanan, aşağıdaki protokol başlangıçta (yani, gökkuşağı alabalığı, Oncorhynchus mykiss, ve Atlantik somon, Salmo salar) salmonid balıklar ve bazı büyük sazanlar (yani balığı, Carassiusauratusauratus) den MPCs ve miyoblastları izole etmek için geliştirilmiştir . 2000 yılında, Fauconneau ve Paboeuf gökkuşağı alabalığı ⁵⁹ için birincil myoblast kültür optimize edilmiş ve minoroptimizations maDanioninae dalının (zebra balığı, Danio rerio ve dev danio, Devario aequipinnatus) nedeniyle Zebra balığı iş için kullanılabilir birçok genetik araçları ³² ve böylece yakın akrabaları birkaç küçük balıklardır kullanılamaması bu protokol de. Kemikli balıklar nedeniyle (en azından çoğu türlerde) onların farklı büyüme stratejisi için çalışma için cazip organizmalardır. Büyük alabalık, çoğu balıklar gibi, hatta yaşlılıkta ^60-62 yılında, olgunluk bir asimptot münezzehtir büyüme potansiyeline sahip, belirsizcesine büyür. Zebra balığı aksine, bu tür dev danio ⁶³ ve teleost balık tipik bıyıklı danio ekran büyüme potansiyelleri, onların doğrudan yan yana PPK hücre kaderinin seçim hipertrofisi karşı iskelet kas hiperplazi bir rolü olup olmadığını anlamak için ideal bir platform yapmak gibi büyük danionins.

Aynı şekilde, nispeten yüksek hücre verimi ve VIAB ile, bu protokol, fareler ve axolotls ile kullanılabileceğini göstermiştirility endeksleri. Böyle Meksika Axolotl (Ambystomamexicanum) olarak Urodele semender, tüm uzuvlar ve kuyrukları ^64-66 gibi dokularını yenilemek için olağanüstü bir yeteneği, sahip. Bu karakteristik iskelet kas kaybı ve yaşlanma bu amfibi ilginç modeller yapar. Bu tür çalışmalar için daha geniş bir karşılaştırmalı bağlam sağlayan, birçok balık türünün de yapıldığı gibi, aşağıda açıklanan protokolünü kullanarak, benzer bir yaklaşım yapılabilir. Gibi birçok gerçekten karşılaştırmalı biyolog veri (burada, bütün omurgalı soy) geniş spektrumu içinde analiz edildiğinde temel biyoloji ve dönüşümsel biyomedikal en anlamlı gelişmeler yapılabilir, takdir.

Protocol

Etik Açıklama: Burada açıklanan omurgalı hayvanları kapsayan tüm deneyler Birmingham Alabama Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından önceden onaylanan ve Laboratuar Hayvan Refahı, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri Ofisi tarafından oluşturulan kurallar ile tutarlı edildi Sağlık ve İnsan Hizmetleri Departmanı. Kültür 1. Hazırlanması (, 2 L başına 26,96 g 13,48 g / L) 9 mM NaHCO 3 (2 L başına 1.51 g), DMEM içind…

Representative Results

Yirmi dört saat sonra tohumlama, miyojenik öncü hücreleri (MPCs) (Şekil 1a ve 1d bakınız) laminin alt tabaka bağlı görünür olmalıdır. Tohumlamadan sonra, hücreler (MPCs) bu hücre tipi göstergesi olan bir mil benzeri bir şekle, (Şekil 1) kabul etmek ve MyoD1 + (Şekil 2) vardır. Danio türlerde, MPCs Oncorhynchus ve Salmo türlerden MPCs göre daha küçük bir bipolar işlemleri ile daha küçük olduğu g?…

Discussion

Miyojenik programı, hangisi incelenen türlerin içinde, en kolay bir in vitro sistemi ile incelenebilir. Nitekim, izolasyon üzerine, miyojenik öncü hücreler (MPCs) balık veya memelilerde myosatellite hücreler (MKH) kolayca çoğalması, hücre döngüsü çekilmesi ve miyoblastların terminal farklılaşma ve doğmakta myotubes bu miyoblastların kaynaşmasını içeren çok iyi düzenlenmiş bu süreci girin. (Zebrabalıkları ⁶⁷ ve ⁶⁹ gökkuşağı alabalığı olası hariç) bal…

Materials

			Table 1. Detailed Reagent Information
Reagent	Company (Preferred v. Alternate)	Catalog Number (Preferred v. Alternate)	Quantity per Culture
γ-irradiated poly-L-lysine	Sigma-Aldrich (MP Biomedicals)	P5899 (ICN19454405)	5 mg
DMEM (high glucose)	Sigma-Aldrich (cellgro)	MT-50-003-PB (D7777)	2 L
Laminin	BD Biosciences (Sigma-Aldrich)	CB-40232 (L2020)	1 mg
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)	BP328-500 (S5761)	1.51 g
HEPES (C8H18N2O4S)	Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)	BP310-1 (H6147)	9.53 g
Antibiotic/Antimycotic	Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)	SV3007901 (A5955)	17-20 mL
Gentamicin Sulfate	Lonza (Sigma-Aldrich)	BW17-519Z (G1397)	2-3 mL
Donor Equine Sera	Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)	SH3007403 (H1270)	75 mL
Fetal Bovine Sera	Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)	SH3007103 (F2442)	25 mL
Collagenase (Type IV)	Worthington (Sigma-Aldrich)	LS004189 (C9891)	0.44 g
Trypsin (from Pancreas)	MP Biomedicals (Sigma-Aldrich)	ICN15357125 (T5266)	1 g
			Table 2. Consumables, Tools and Equipment
Consumable	Tools	Equipment
Cell Culture Plates	Forceps (Coarse)	Serological Pipettor
Sterile 50 mL Conical Tubes	Forceps (Fine)	pH Meter
Laboratory Tape	Scalpel Handles	Chilling Incubator (Echotherm)
0.2 μm Vacuum Sterilization Systems	Scalpel Blades (#10, #11)	Laminar Flow Hood
Water-repellant Autoclave Paper	Surgical Scissors	Vacuum Manifold
Serological Pipettes	Glass Petri Dishes	Microosmolality Meter
	12-16 G Cannulas with Luer Locks
			Table 3. Optimized Volumes for Coating Cell Culture Plates
Plate Size	cm^2 per Well	Poly-L-lysine*	Laminin**
6 well	9.5	1.6 mL	1
24 well	1.9	0.32	0.2
48 well	0.95	0.16	0.1
96 well	0.32	0.06	0.03
*0.1 mg/mL concentration	** 0.020 mg/mL concentration
			Table 4. Media for Isolation, Dissociation, and Culture
Reagent	Isolation	Wash	Dissociation	Complete
Base Medium	419.25 mL	395.40 mL	297.00 mL	178.00 mL
PSF*	5.00 mL	4.00 mL	3.00 mL	2.00 mL
Gentamicin Sulfate**	0.75 mL	0.60 mL	–	–
Donor Equine Serum	75.00 mL	–	–	–
Fetal Bovine Serum***	–	–	–	20.00 mL
* PSF: penicillin/streptomycin/fungizone cocktail (100x); ** 50 mg/mL concentration; *** Characterized
			Table 5. Recommended Dilutions and Plating Volumes
Plate Size	cm^2 per Well	Dilution	Plating Volume
6 well	9.5	1.5-2.0×10^6 cells/mL	1 mL
24 well	1.9	1.5-2.0×10^6 cells/mL	250 μL
48 well	0.95	1.5-2.0×10^6 cells/mL	150 μL
96 well	0.32	1.5-2.0×10^6 cells/mL	50-100 μL
			Table 6. Average number of cells per g tissue
Species		Average # cells/g tissue
Danio rerio		6,400,000
Danio dangila		1,783,000
Devario aequipinnatus		1,797,000
Oncorhynchus mykiss		66,800
			Table 7. Recommended Incubation Temperatures
Species		Temperature
Danio/ Devario spp.		26 – 28 °C
Oncorhynchus/Salmo spp.		10* – 18 °C
Ambystoma mexicanum		18°C
* Lower temperatures support lower proliferation rates.