Het meten van de osmotische Waterdoorlaatbaarheid (P<sub> F</sub>) Van Sferische Cellen: Isolated plantenprotoplasten als voorbeeld
Summary
Het meten van de osmotische waterdoorlatendheid coëfficiënt (P f) van de cellen kan helpen begrijpen van de regelgeving van aquaporines (AQPs). F bepaling P sferische plantencel protoplasten gepresenteerde omvat protoplasten isolatie en numerieke analyse van de initiële snelheid van volumeverandering als gevolg van een osmotische uitdaging bij constant bad perfusie.
Abstract
Studeren AQP regulatiemechanismen is cruciaal voor het begrip van water relaties bij zowel de cellulaire en de hele plant niveaus. Hier voorgesteld is een eenvoudige en zeer efficiënte methode voor de bepaling van de osmotische water permeabiliteit coëfficiënt (P f) in plantenprotoplasten, in principe ook toepasbaar op andere sferische cellen zoals kikker oocyten. De eerste stap van de assay is de isolatie van protoplasten uit het plantenweefsel plaats door enzymatische digestie in een kamer met een geschikte isotone oplossing. De tweede stap bestaat uit een osmotisch challenge test: protoplasten geïmmobiliseerd op de bodem van de kamer wordt onderworpen aan een constante perfusie start met een isotone oplossing en vervolgens een hypotone oplossing. De cel zwelling is video opgenomen. In de derde stap worden de beelden offline bewerkt om volumeveranderingen opleveren, en het tijdsverloop van de volumeveranderingen samenhangt met het tijdsverloop van de verandering in osmolaligheid van de kamer perfusie medium, met behulp van een curve fitting procedure geschreven in Matlab (de 'PfFit'), naar P f opleveren.
Introduction
Opname van water en stroom over cellulaire membranen is een fundamentele vereiste voor planten bestaan op zowel de cellulaire en de hele plant niveaus. Op cellulair niveau, aquaporines (AQPs) spelen een belangrijke rol in de regulatie van de osmotische waterdoorlatendheid coëfficiënt (P f) van de celmembraan 1-3.
Tot op heden zijn verscheidene werkwijzen toegepast bij het meten van de endogene P f protoplast van verschillende plantenorganen (bijvoorbeeld wortels, mesofyl, endodermis, etc., Beoordeeld door Chaumont et al. 4). Een van de benaderingen P f meten is de protoplasten blootgesteld aan een osmotische uitdaging en de initiële snelheid van de volumeverandering monitor (dwz. De helling van het eerste lineaire fase van de volumeverandering). Twee verschillende methoden eerder beschreven op basis van deze aanpak, beide betrokken op het direct uitwisselen van oplossingen. De eerste bestaat uit immobilizing de protoplast met een zuig micropipet en schakelen de vloeistoftoevoer 5 en de tweede overdracht van de protoplast van de ene naar de andere oplossing met een micropipet 6. Deze micropipet zuig en micropipet overdracht methoden die beeldacquisitie aan het begin van de snelle oplossing uitwisseling mogelijk maakt (naar de eerste lineaire fase van volumeverandering vangen), zal leiden tot een fysieke stress protoplasten en vereisen gespecialiseerde apparatuur en expert micromanipulatie.
De hier beschreven methode minimaliseert de verstoring van de cellen, omvat geen micromanipulatie en maakt afleiding van P f bij het bad perfusie niet onmiddellijk.
Na de enzymatische vertering, de protoplasten, ondergedompeld in een isotone oplossing, worden geïmmobiliseerd op het dekglaasje-glazen bodem van een plexiglas (aka Lucite of perspex) kamer door lading interactie. Vervolgens, tijdens een constante bad perfusiede isotone oplossing wordt weggespoeld door een hypotonische oplossing genereren van een hypoosmotic uitdaging voor de protoplasten. De zwelling van de protoplast is video opgenomen en vervolgens, door het combineren van de informatie over het tijdsverloop van het bad perfusie en het tijdsverloop van de cel zwelling wordt de P f bepaald door beeldverwerking en curve fitting procedures.
De voordelen van deze methode zijn dat de experiment is zeer efficiënt, Het is mogelijk om enkele cellen kan waarnemen in een enkele assay, en dat het geen speciale apparatuur of bijzondere micromanipulatie vaardigheden. Verschillende toepassingen voor deze methode mogelijk. Bijvoorbeeld, bepaling van de natieve P f van een verscheidenheid van cellen van verschillende weefsels en planten, zoals mesofyl en bundelschede cellen van Arabidopsis leaf 7, maïs bladmesofylcellen of wortelcortex cellen 8-10 of suspensie gekweekte cellen 11,12. In additiop, is het mogelijk om P f bolvormige dierlijke cellen te bepalen zoals eicel cellen 11. Een ander voorbeeld betreft onderzoek AQP-activiteit door tijdelijke expressie van het gen in de protoplasten (of andere genen die deze kunnen beïnvloeden, bijvoorbeeld genen kinasen) en bepaling van hun bijdrage aan P f; bijvoorbeeld expressie van tomaat AQP SlTIP2; 2 in Arabidopsis mesophyll protoplasten door PEG transformatie en de vastberadenheid van de SlTIP2; 2-gerelateerde P f 13. Tenslotte onderzoek van het effect op P f van verschillende moleculen / stoffen (drugs, hormonen, etc.) aan de oplossingen toegevoegd kan worden onderzocht, bijvoorbeeld van de AQP blocker HgCl2 7.
Het volgende protocol beschrijft de isolatie van protoplasten van Arabidopsis mesofylcellen en bepaling van de P f.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreven is een eenvoudige en zeer efficiënte procedure voor het meten van de P f van geïsoleerde plantenprotoplasten in principe ook toepasbaar op andere bolvormige cellen, bijvoorbeeld., Kikker eicellen 11. Deze methode is gebaseerd op het meten van de P f in reactie op een osmotische uitdaging voor de cel. In tegenstelling tot de andere methoden op basis van deze benadering is echter de verandering van oplossingen, dat wil zeggen van de osmolariteit, niet on…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van het Nationaal Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FNRS), de Interuniversitaire Attractie Polen Programma-Federaal Wetenschapsbeleid en de "Communaute française de Belgique-acties de Recherches Concertées" om FC, uit de Israel Science Foundation Jeruzalem ( ISF) naar MM (Grant # 1311-1312), en NM (Grant # 1312-1312).
Materials
| KCl | Chem-Impex International | 01247-1 | http://www.chemimpex.com Any source, anal. grade |
| CaCl2 | Merck | 11718006 | http://www.merck.com Any source, anal. grade |
| 2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES) | Sigma | 15152002 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| D-Sorbitol | Sigma | 18032003 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| Cellulase | Worthington, Lakewood, NJ, USA | LS002603 | http://www.worthingtonbiochem.com |
| Pectolyase | Karlan, Phonix, AZ, USA | 8006 | http://www.karlan.com |
| Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP) | Sigma | 81420 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9418-5G | http://www.sigmaaldrich.com |
| Protamine sulphate | Sigma | P4380 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Silicone vacuum grease heavy | Merck | 107921 | https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&SEO_ErrorPageOccurred=true&attachments=CoA |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100/TS100F | http://www.nikoninstruments.com |
| Peristaltic pump | BIO-RAD | EP-1 Econo Pump | http://www.bio-rad.com |
| Grayscale digital camera | Scion Corporation | CFW-1308M | http://www.scioncorp.com |
| CMU 1394 Camera Driver’ plugin for ImageJ | Carnegie Mellon | http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html Free software |
|
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ Free software |
|
| Econo Gradient Pump Fittings Kit | BIO-RAD | 731-9006 | http://www.bio-rad.com |
| Connectors, manifold | DirectMed | http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S | |
| Burette infusion sets (columns) | Welford | IF-BR-001 | http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61 |
| Tubing | TYGON | R-3603 | http://www.usplastic.com |
| Plexiglass slide etc. | Perspectiv | http://www.perspectiv.co.il/index-en.html Our slide was custom-made, it does not appear on the web site but a copy can be remade to order as 'a copy of the slide already made for M. Moshelion'. |
|
| 3M packaging Scotch tape 1'', clear | Viking Industrial, UK | VKMONO25 | http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8 any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK |
References
- Tyerman, S. D., Niemietz, C. M., Bramley, H. Plant aquaporins: multifunctional water and solute channels with expanding roles. Plant Cell Environ. 25, 173-194 (2002).
- Maurel, C. Plant aquaporins: Novel functions and regulation properties. Febs Letters. 581, 2227 (2007).
- Maurel, C., Verdoucq, L., Luu, D. T., Santoni, V. Plant aquaporins: Membrane channels with multiple integrated functions. Annual Review of Plant Biology. 59, 595 (2008).
- Chaumont, F., Moshelion, M., Daniels, M. J. Regulation of plant aquaporin activity. Biology Of The Cell. 97, 749-764 (2005).
- Ramahaleo, T., Morillon, R., Alexandre, J., Lassalles, J. P. Osmotic water permeability of isolated protoplasts. Modifications during development. Plant Physiology. 119, 885-896 (1999).
- Suga, S., Murai, M., Kuwagata, T., Maeshima, M. Differences in aquaporin levels among cell types of radish and measurement of osmotic water permeability of individual protoplasts. Plant Cell Physiol. 44, 277-286 (2003).
- Shatil-Cohen, A., Attia, Z., Moshelion, M. Bundle-sheath cell regulation of xylem-mesophyll water transport via aquaporins under drought stress: a target of xylem-borne ABA?. The Plant Journal. 67, 72-80 (2011).
- Hachez, C., Moshelion, M., Zelazny, E., Cavez, D., Chaumont, F. Localization and quantification of plasma membrane aquaporin expression in maize primary root: A clue to understanding their role as cellular plumbers. Plant Molecular Biology. 62, 305-323 (2006).
- Hachez, C., Heinen, R. B., Draye, X., Chaumont, F. The expression pattern of plasma membrane aquaporins in maize leaf highlights their role in hydraulic regulation. Plant Molecular Biology. 68, 337-353 (2008).
- Besserer, A., et al. Selective regulation of maize plasma membrane aquaporin trafficking and activity by the SNARE SYP121. The Plant Cell. 24, 3463-3481 (2012).
- Moshelion, M., Moran, N., Chaumont, F. Dynamic changes in the osmotic water permeability of protoplast plasma membrane. Plant Physiology. 135, 2301-2317 (2004).
- Moshelion, M., et al. Membrane water permeability and aquaporin expression increase during growth of maize suspension cultured cells. Plant, Cell & Environment. 32, 1334-1345 (2009).
- Sade, N., et al. Improving plant stress tolerance and yield production: is the tonoplast aquaporin SlTIP2;2 a key to isohydric to anisohydric conversion?. New Phytologist. 181, 651-661 (2009).
- Volkov, V., et al. Water permeability differs between growing and non-growing barley leaf tissues. J. Exp. Bot. 58, 377 (2007).
- Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount. Plant Cell Reports. 21, 865-871 (2003).
- Hosy, E., Duby, G., Véry, A. A., Costa, A., Sentenac, H., Thibaud, J. B. A procedure for localisation and electrophysiological characterisation of ion channels heterologously expressed in a plant context. Plant Methods. 19, (2005).
- Shoseyov, O., Posen, Y., Grynspan, F. Human Recombinant Type I Collagen Produced in Plants. Tissue Eng Part A. 19, 1527-1533 (2013).
