浸透水透過係数（Pの測定<sub> F</sub>）球状細胞の：例として単離された植物プロトプラスト
Summary
細胞の浸透水透過係数（P fは ）測定することは、アクアポリンの調節機構（AQPs）を理解するのに役立ちます。ここに提示球状植物細胞プロトプラストにおけるP fの決定は、プロトプラストの単離および一定の浴潅流の間の浸透圧のチャレンジの結果としての体積変化のそれらの初期速度の数値解析を伴う。
Abstract
AQP調節機構を研究することは、細胞および全植物の両方のレベルでの水関係の理解のために重要である。ここで紹介するようなカエル卵母細胞などの他の球状の細胞にも原理的に適用可能な植物プロトプラストにおける浸透水透過係数（P fを ）決定するための簡単かつ非常に効率的な方法です。アッセイの最初のステップは、適切な等張液と室内への酵素的消化により関心対象の植物組織からのプロトプラストの単離である。第二段階は、浸透圧の挑戦アッセイで構成されています。室の底に固定化されたプロトプラストは、等張液で始まる定数灌流に提出し、低張液が続いている。細胞膨張は、ビデオ記録される。第三のステップでは、画像は体積変化を得るために、オフライン処理され、体積変化の時間経過をosmola変化の時間経過と相関しているチャンバ灌流培地のrity、P fで得た、Matlabの（ 'PfFit'）で記述された曲線当てはめ手順を使用する。
Introduction
水の取り込みと細胞膜を横切って流れるが、細胞および全植物の両方のレベルでの植物の存在の基本的な要件です。細胞レベルでは、アクアポリン（AQPs）は、細胞膜1-3の浸透水透過係数（P fの ）の調節において重要な役割を果たす。
現在までに、いくつかの方法は、異なる植物器官からのプロトプラストのfを内因Pを測定するために採用されている（ すなわち 、根、葉、内皮、 等 、ショーモンらによって概説4）。 P fを測定するためのアプローチの一つは、浸透チャレンジにプロトプラストを露出させるために、その体積変化（ すなわち 、体積変化の初期の線形位相の傾き）の初期速度を監視することである。二つの異なる方法が以前に両方の溶液の瞬間的な交換に基づいて、このアプローチに基づいて説明した。最初のものはimmobilizで構成されてい吸引マイクロピペットでプロトプラストをると溶液流5とマイクロピペット6を使用して別の溶液からプロトプラストを転送する第1の切り替え。高速の溶液交換の非常に開始時の画像取得を可能にするこれらのマイクロピペット吸引マイクロピペットの転送方法は、可能性が高いプロトプラストへの物理的なストレスを伴う、（体積変化の早い直線位相を捕捉する）と、特殊な装置や専門家のマイクロマニピュレーションを必要とします。
ここで説明する方法はマイクロマニピュレーションを伴わない浴潅流が瞬間的でない場合、P fの導出を可能にし、細胞への障害を最小限に抑えることができます。
酵素消化の後、等張液に沈めプロトプラストは、電荷相互作用によってプレキシガラス（別名ルーサイトまたはパースペックス）チャンバーのカバースリップガラスの底に固定化される。その後、一定の入浴灌流の間に、等張液をプロトプラストに低浸透圧の挑戦を生成する低張液によって洗い流されている。プロトプラストの膨潤は、映像を記録した後、浴灌流の時間経過および細胞膨潤の時間経過に関する情報を組み合わせることにより、P fは画像処理及び曲線適合手順によって決定される。
この方法の利点は、実験は非常に効率的であること、それが単一のアッセイにおいて同時に少数の細胞を監視することが可能であり、それは特別な機器や特定のマイクロマニピュレーション技術を必要としないこと、すなわち 。この方法のためのいくつかの応用が可能である。例えば、このような葉肉などの異なる組織や植物由来の細胞のさまざまなネイティブのP fの決定とシロイヌナズナの葉7、トウモロコシの葉の葉肉や根皮質細胞8-10または懸濁液培養細胞11,12から鞘細胞をバンドル。 additiでに、そのような卵母細胞11のような球状の動物細胞のP fはを決定することが可能である。 P fに貢献すると決意;もう一つの例は、プロトプラスト（ 例えば 、キナーゼの遺伝子またはいずれかの他の遺伝子に影響を与える場合があります）でのそれらの遺伝子の一過性発現によりAQP活動の検討を必要とする。例えば、トマトAQP SlTIP2の発現; PEG変換と決定SlTIP2によるシロイヌナズナ葉肉プロトプラストにおける2; 2関連P 13 F。最後に、溶液に添加異なる分子/物質（薬物、ホルモンなど）のfを Pに対する効果の検討もAQPブロッカーのHgCl 2 7の例について、調べることができる。
以下のプロトコルは、シロイヌナズナの葉肉細胞とそれらのP fの決定のプロトプラストの単離を記載している。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明すると、他の球状の細胞にも原理的に適用可能な単離された植物プロトプラストのP fを 、 例えば 、カエル卵母細胞11を測定するための簡単かつ非常に効率的な手順です。この方法は、細胞への浸透性投与に応答して、P fは測定することに基づいている。このアプローチに基づく他の方法とは対照的に、しかし、浸透圧モル濃度の溶液の変化、 す…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、イスラエル科学財団エルサレム（から、FCへの研究（FNRS）C科学的ベルギー国民基金、大学間アトラクション極プログラム – ベルギー科学政策と「RecherchesConcertéesデCommunautéフランセーズデベルギー·アクション」からの補助金によってサポートされていましたMM（助成番号1311から1312）にISF）、およびNM（助成番号1312から1312）へ。
Materials
| KCl | Chem-Impex International | 01247-1 | http://www.chemimpex.com Any source, anal. grade |
| CaCl2 | Merck | 11718006 | http://www.merck.com Any source, anal. grade |
| 2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES) | Sigma | 15152002 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| D-Sorbitol | Sigma | 18032003 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| Cellulase | Worthington, Lakewood, NJ, USA | LS002603 | http://www.worthingtonbiochem.com |
| Pectolyase | Karlan, Phonix, AZ, USA | 8006 | http://www.karlan.com |
| Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP) | Sigma | 81420 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9418-5G | http://www.sigmaaldrich.com |
| Protamine sulphate | Sigma | P4380 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Silicone vacuum grease heavy | Merck | 107921 | https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&SEO_ErrorPageOccurred=true&attachments=CoA |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100/TS100F | http://www.nikoninstruments.com |
| Peristaltic pump | BIO-RAD | EP-1 Econo Pump | http://www.bio-rad.com |
| Grayscale digital camera | Scion Corporation | CFW-1308M | http://www.scioncorp.com |
| CMU 1394 Camera Driver’ plugin for ImageJ | Carnegie Mellon | http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html Free software |
|
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ Free software |
|
| Econo Gradient Pump Fittings Kit | BIO-RAD | 731-9006 | http://www.bio-rad.com |
| Connectors, manifold | DirectMed | http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S | |
| Burette infusion sets (columns) | Welford | IF-BR-001 | http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61 |
| Tubing | TYGON | R-3603 | http://www.usplastic.com |
| Plexiglass slide etc. | Perspectiv | http://www.perspectiv.co.il/index-en.html Our slide was custom-made, it does not appear on the web site but a copy can be remade to order as 'a copy of the slide already made for M. Moshelion'. |
|
| 3M packaging Scotch tape 1'', clear | Viking Industrial, UK | VKMONO25 | http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8 any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK |
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