삼투 물 투수 계수 (P 측정<sub> F</sub>) 구형 세포 : 예를 들어 식물 절연 원형질체
Summary
세포의 삼투 투수 계수 (P의 F)를 측정하는 것은 아쿠아 포린의 규제 메커니즘 (AQPs)를 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기에 제시된 구면 식물 세포 원형질체에서 P F 형 결정은 원형질체 분리 욕조와 일정한 관류 동안 삼투 도전 결과로서 부피 변화의 초기 레이트의 수치 분석을 포함한다.
Abstract
AQP 규제 메커니즘을 공부하는 것은 세포 및 전체 공장 수준 모두에서 물 관계의 이해에 매우 중요합니다. 삼투 투수 계수 식물 원형질체에서 (P에 F), 예컨대 개구리 난 모세포와 같은 다른 세포 구형도 원칙의 적용을위한 판단이 매우 간단하고 효율적인 방법이 여기에서 제시 하였다. 분석의 첫 번째 단계는 적절한 등장 성 용액 챔버로 효소 분해에 의해 관심의 식물 조직으로부터 원형질체의 분리이다. 두 번째 단계는 삼투 도전 세이로 구성 챔버의 바닥면에 고정화 된 원형질체는 저장성 용액하여 등장액으로 일정한 관류 시작하고 그 다음에 제출된다. 세포 부종 비디오 기록이다. 세 번째 단계에서, 이미지는 부피 변화를 수득 오프라인 처리되어 부피 변화의 시간 코스는 osmola의 변화의 시간 경과와 상관챔버 관류 매체의 RITY, P의 F를 산출하기 위해, matlab에 ( 'PfFit')로 작성된 커브 피팅 절차를 사용하여.
Introduction
세포막에 걸쳐 물 흡수와 흐름은 셀룰러 및 전체 공장 수준 모두에서 식물의 존재에 대한 기본적인 요구 사항입니다. 세포 수준에서, 아쿠아 포린 (AQPs)는 세포막 1-3의 삼투 투수 계수 (P의 F)의 조절에 중요한 역할을한다.
지금까지 여러 가지 방법으로 다른 식물 기관에서 원형질체의 내생 P f를 측정에 사용되어왔다 (즉 뿌리, 엽육, endodermis 등., 쇼몽 등. 4 검토). P f를 측정하는 방법 중 하나는 삼투 도전 원형질체을 노출하고 그 부피 변화의 초기 속도를 모니터링 할 수있다 (예., 체적 변화의 초기 선형 단계의 기울기). 두 가지 방법은 이전에 용액의 순간 과거에이 방법에 기초하여 설명 모두 기초 하였다. 첫 번째는 immobiliz 구성마이크로 피펫으로 흡입 원형질체를 보내고 용액 흐름 5 및 6 마이크로 피펫을 사용하여 다른 하나의 용액으로부터 원형질체를 전송하는 두 번째 스위칭. 빠른 용액 교환 매우 시작에서 화상 획득을 허용 한 마이크로 피펫 흡입 및 마이크로 피펫 전사 방법은, 가능성 원형질체에 대한 물리적 스트레스를 수반, (부피 변화의 초기 선형 위상을 포착하기 위해) 및 특수 장비 및 전문가 미세 조작을 필요로한다.
여기서 설명한 방법은 더 미세 조작을 수반하지 않고 목욕 관류 순시 없을 때 P (F)의 유도를 허용하는, 세포에 교란을 최소화한다.
효소 분해 한 후, 등장 성 용액에 잠긴 원형질체는, 전하의 상호 작용에 의해 coverslip에 유리 플렉시 글라스의 바닥 (일명 플라스틱 유리 또는 방풍) 챔버에 고정된다. 그리고, 일정 기간 동안 관류 목욕,등장 성 용액은 원형질체에 hypoosmotic 도전을 생성하는 저장성 용액에 의해 멀리 플러시됩니다. 원형질체의 팽윤 비디오 기록하고, 목욕 관류의 시간 과정 및 세포 종창의 시간 경과에 대한 정보를 조합하여, P의 F는 화상 처리 및 커브 피팅 절차에 의해 결정된다.
이 방법의 장점은, 실험이 매우 효율적임을 아르는 단일 분석에서 동시에 몇 개의 셀을 모니터하는 것이 가능하고, 특별한 장비 나 특별한 기술이 미세 조작을 필요로하지 않는다는 것을, 즉. 이 방법에 대한 몇 가지 응용이 가능하다. 예를 들면, 엽육 같은 다른 조직 및 식물의 세포의 다양한 네이티브 P (F)의 결정 및 아라비돕시스 잎 07 옥수수 잎 엽육 또는 루트 피질 세포 8-10 또는 현탁 배양 세포 (11, 12)에서 시쓰 세포 번들. additi에서에, 이러한 난자 전지 (11)로서 구형 동물 세포의 P의 F를 결정하는 것이 가능하다. P의 F 기여도의 판정과, 또 다른 예는 원형질체 (예 네이즈의 유전자 또는 다른 유전자에 영향을 미칠 수있는 그들)에서의 유전자의 일시적 발현으로 AQP 활성의 시험을 포함한다; 이 PEG 변환 및 결정 SlTIP2하여 애기 장대 엽육 원형질체의, 예, 토마토 AQP SlTIP2의 표현 (13) f를 P를 2 관련. 마지막으로, (등 약물, 호르몬,) 다른 분자 / 물질 P의 F에 미치는 영향의 검토도 AQP 차단제 HgCl 2 (7)의 예를 들면, 검사 할 수있는 솔루션에 추가됩니다.
다음 프로토콜은 애기 장대 엽육 세포와 그들의 P (F)의 결정의 원형질체의 분리에 대해 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서 설명하는 다른 세포에 구면도 원칙적으로 적용 절연 식물 원형질체의 P f를, 예를 들면., 개구리 난 모세포 (11)를 측정하기위한 간단하고 매우 효율적인 절차이다. 이 방법은 세포에 침투 챌린지에 응답하여 상기 P F의 측정에 기초한다. 이러한 접근 방식에 기초하여 상기 다른 방법과는 대조적으로, 그러나, 삼투압의 해법의 변화, 즉, 기저 세포 부피가…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 연구 (FNRS) C 과학적위한 벨기에 기금 보조금, 이스라엘 과학 재단 예루살렘 FC에 Interuniversity 명소 폴란드 프로그램 – 벨기에 과학 정책 및 "Recherches Concertées 드 Communauté 프랑세즈 드 Belgique – 작업"(에 의해 지원되었다 MM (부여 # 12분의 1,311)에 ISF) 및 NM (부여 # 12분의 1,312)이다.
Materials
| KCl | Chem-Impex International | 01247-1 | http://www.chemimpex.com Any source, anal. grade |
| CaCl2 | Merck | 11718006 | http://www.merck.com Any source, anal. grade |
| 2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES) | Sigma | 15152002 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| D-Sorbitol | Sigma | 18032003 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| Cellulase | Worthington, Lakewood, NJ, USA | LS002603 | http://www.worthingtonbiochem.com |
| Pectolyase | Karlan, Phonix, AZ, USA | 8006 | http://www.karlan.com |
| Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP) | Sigma | 81420 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9418-5G | http://www.sigmaaldrich.com |
| Protamine sulphate | Sigma | P4380 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Silicone vacuum grease heavy | Merck | 107921 | https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&SEO_ErrorPageOccurred=true&attachments=CoA |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100/TS100F | http://www.nikoninstruments.com |
| Peristaltic pump | BIO-RAD | EP-1 Econo Pump | http://www.bio-rad.com |
| Grayscale digital camera | Scion Corporation | CFW-1308M | http://www.scioncorp.com |
| CMU 1394 Camera Driver’ plugin for ImageJ | Carnegie Mellon | http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html Free software |
|
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ Free software |
|
| Econo Gradient Pump Fittings Kit | BIO-RAD | 731-9006 | http://www.bio-rad.com |
| Connectors, manifold | DirectMed | http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S | |
| Burette infusion sets (columns) | Welford | IF-BR-001 | http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61 |
| Tubing | TYGON | R-3603 | http://www.usplastic.com |
| Plexiglass slide etc. | Perspectiv | http://www.perspectiv.co.il/index-en.html Our slide was custom-made, it does not appear on the web site but a copy can be remade to order as 'a copy of the slide already made for M. Moshelion'. |
|
| 3M packaging Scotch tape 1'', clear | Viking Industrial, UK | VKMONO25 | http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8 any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK |
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