מדידת אוסמוטי המים החדירות מקדם (P<sub> F</sub>) של תאים כדוריים: Protoplasts צמח מבודד כדוגמה
Summary
מדידה מקדם האוסמוטי חדירות מים (ו P) של תאים יכול לעזור להבין את מנגנוני הרגולציה של aquaporins (AQPs). נחישות f P בprotoplasts תא צמח הכדורי המוצג כאן כוללת בידוד protoplasts וניתוח מספרי של השיעור הראשון שלהם שינוי נפח כתוצאה מאתגר האוסמוטי במהלך זלוף אמבטיה הקבוע.
Abstract
חקר מנגנוני רגולציה AQP הוא קריטי להבנה של יחסי מים בסלולריים ורמות הצמח כולו שניהם. מוצג כאן היא שיטה פשוטה ויעילה מאוד לקביעת מקדם חדירות מים האוסמוטי (ו P) בprotoplasts צמח, החלים באופן עקרוני גם לתאים כדוריים אחרים כגון ביציות צפרדע. הצעד הראשון של assay הוא הבידוד של protoplasts מרקמות הצמח של ריבית על ידי עיכול אנזימטי לתא עם תמיסה איזוטונית מתאימה. הצעד השני מורכב מassay אתגר האוסמוטי: protoplasts המשותק בחלקו התחתון של החדר מוגשים להתחלת זלוף מתמיד עם תמיסה איזוטונית ואחריו פתרון hypotonic. נפיחות התא היא וידאו מוקלט. בשלב השלישי, התמונות מעובדות מחובר להניב שינויי נפח, וכמובן של שינויי נפח הזמן מתואם עם מהלך השינוי בosmola הזמןטוהרתו של מדיום התא זלוף, באמצעות הליך ראוי עקומה נכתב Matlab ('PfFit'), כדי להניב f P.
Introduction
ספיגת מים וזרימה על פני ממברנות תאים היא דרישה בסיסית לקיום מפעל בסלולרי ורמות הצמח כולו שניהם. ברמה התאית, aquaporins (AQPs) לשחק תפקיד מפתח בוויסות של המקדם האוסמוטי חדירות מים (ו P) של קרום תא 1-3.
נכון להיום, כמה שיטות כבר מועסקות במדידת f P אנדוגני של protoplast מאיברי צמח שונים (כלומר שורשים, mesophyll, endodermis, וכו '., נסקרו על ידי Chaumont et al. 4). אחת הגישות למדידת f P הוא לחשוף את protoplasts לאתגר האוסמוטי ולעקוב אחר שיעוריו הראשוניים של שינוי הנפח שלה (כלומר., השיפוע של השלב ליניארי המוקדם של שינוי הנפח). שתי שיטות שונות שתוארו לעיל מבוססת על גישה זו, שניהם מבוססות על חילופי מיידיים של פתרונות. הראשון מורכב מimmobilizing protoplast עם micropipette יניקה ומיתוג זרימת פתרון 5 ושנייה אחת של העברת protoplast מפתרון אחד למשנהו באמצעות micropipette 6. שיטות אלה יניקת micropipette וmicropipette העברה, המאפשרות רכישת תמונה בתחילת מאוד של חילופי פתרון מהירים (כדי ללכוד את השלב ליניארי המוקדם של שינוי נפח), ככל הנראה כרוכות לחץ פיזי לprotoplasts ודורשות ציוד מיוחד ומיקרומניפולציה מומחה.
השיטה המתוארת כאן ממזערת ההפרעה לתאים, אינו כרוכה במיקרומניפולציה ומאפשר גזירה של f P כאשר זלוף האמבטיה אינו מיידי.
לאחר עיכול אנזימטי, protoplasts, שקוע בתמיסה איזוטונית, הם משותקים בחלקו התחתון coverslip הזכוכית של פרספקס (aka Lucite או פרספקס) תא על ידי אינטראקציה תשלום. לאחר מכן, במהלך זלוף אמבטיה קבוע,התמיסה איזוטונית הוא הסמיק משם על ידי פתרון hypotonic יצירת אתגר hypoosmotic לprotoplasts. הנפיחות של protoplast היא וידאו מוקלט ולאחר מכן, על ידי שילוב של המידע על מהלך הזמן של זלוף האמבטיה וכמובן של נפיחות תא הזמן, f P נקבעה על ידי עיבוד תמונה ונהלים מתאימים עקום.
היתרונות של שיטה זו הם שהניסוי הוא יעיל מאוד, כלומר אפשר לעקוב אחר כמה תאים בו זמנית בassay יחיד, ושהיא אינה דורשת ציוד מיוחד או כישורי מיקרומניפולציה מסוימים. מספר יישומים עבור שיטה זו הם אפשריים. לדוגמא, קביעת f P יליד מגוון של תאים מרקמות שונות וצמחים, כגון mesophyll וצרור תאי נדן מעלה ארבידופסיס 7, mesophyll עלה תירס או תאי שורש קליפת 8-10 או תאים בתרבית השעיה 11,12. בadditiב, ניתן לקבוע f P של תאי בעלי חיים כדוריים כגון תאי ביצית 11. דוגמא נוספת כרוכה בדיקה של פעילות AQP ידי ביטוי החולף של הגן שלהם בprotoplasts (או כל גנים אחרים אשר עשוי להשפיע עליהם, לדוגמה, הגנים של קינאז) ונחישות של תרומתם לf P; קשור 2-P f 13, למשל, ביטוי של עגבניות AQP SlTIP2; 2 בprotoplasts mesophyll ארבידופסיס על ידי שינוי PEG ונחישות SlTIP2. לבסוף, בחינה של ההשפעה על f P של מולקולות / חומרים שונים (תרופות, הורמונים, וכו ') הוסיפה לפתרונות יכול גם להיבחן, למשל של חוסם AQP HgCl 2 7.
הפרוטוקול הבא מתאר את הבידוד של protoplasts של התאים והנחישות של f P mesophyll ארבידופסיס.
Protocol
Representative Results
Discussion
מתואר כאן הוא תהליך פשוט ויעיל מאוד למדידת f P של protoplasts מפעל המבודד, החלים באופן עקרוני גם לתאים כדוריים אחרים, למשל., ביציות צפרדע 11. שיטה זו מבוססת על מדידת f P בתגובה לאתגר האוסמוטי לתא. בניגוד לשיטות האחרות המבוססות על גישה זו, עם זאת, השינוי של ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית הבלגית לfi המדעי ג המחקר (FNRS), האטרקציה הבינאוניברסיטאי הפולנים תכנית הבלגית המדע ומדיניות "Communauté Française דה Belgique-Actions דה Recherches Concertées" לFC, מהקרן הלאומית למדע בירושלים ( ISF) לMM (גרנט # 1311-1312), ולNM (גרנט # 1312-1312).
Materials
| KCl | Chem-Impex International | 01247-1 | http://www.chemimpex.com Any source, anal. grade |
| CaCl2 | Merck | 11718006 | http://www.merck.com Any source, anal. grade |
| 2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES) | Sigma | 15152002 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| D-Sorbitol | Sigma | 18032003 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| Cellulase | Worthington, Lakewood, NJ, USA | LS002603 | http://www.worthingtonbiochem.com |
| Pectolyase | Karlan, Phonix, AZ, USA | 8006 | http://www.karlan.com |
| Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP) | Sigma | 81420 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9418-5G | http://www.sigmaaldrich.com |
| Protamine sulphate | Sigma | P4380 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Silicone vacuum grease heavy | Merck | 107921 | https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&SEO_ErrorPageOccurred=true&attachments=CoA |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100/TS100F | http://www.nikoninstruments.com |
| Peristaltic pump | BIO-RAD | EP-1 Econo Pump | http://www.bio-rad.com |
| Grayscale digital camera | Scion Corporation | CFW-1308M | http://www.scioncorp.com |
| CMU 1394 Camera Driver’ plugin for ImageJ | Carnegie Mellon | http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html Free software |
|
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ Free software |
|
| Econo Gradient Pump Fittings Kit | BIO-RAD | 731-9006 | http://www.bio-rad.com |
| Connectors, manifold | DirectMed | http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S | |
| Burette infusion sets (columns) | Welford | IF-BR-001 | http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61 |
| Tubing | TYGON | R-3603 | http://www.usplastic.com |
| Plexiglass slide etc. | Perspectiv | http://www.perspectiv.co.il/index-en.html Our slide was custom-made, it does not appear on the web site but a copy can be remade to order as 'a copy of the slide already made for M. Moshelion'. |
|
| 3M packaging Scotch tape 1'', clear | Viking Industrial, UK | VKMONO25 | http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8 any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK |
References
- Tyerman, S. D., Niemietz, C. M., Bramley, H. Plant aquaporins: multifunctional water and solute channels with expanding roles. Plant Cell Environ. 25, 173-194 (2002).
- Maurel, C. Plant aquaporins: Novel functions and regulation properties. Febs Letters. 581, 2227 (2007).
- Maurel, C., Verdoucq, L., Luu, D. T., Santoni, V. Plant aquaporins: Membrane channels with multiple integrated functions. Annual Review of Plant Biology. 59, 595 (2008).
- Chaumont, F., Moshelion, M., Daniels, M. J. Regulation of plant aquaporin activity. Biology Of The Cell. 97, 749-764 (2005).
- Ramahaleo, T., Morillon, R., Alexandre, J., Lassalles, J. P. Osmotic water permeability of isolated protoplasts. Modifications during development. Plant Physiology. 119, 885-896 (1999).
- Suga, S., Murai, M., Kuwagata, T., Maeshima, M. Differences in aquaporin levels among cell types of radish and measurement of osmotic water permeability of individual protoplasts. Plant Cell Physiol. 44, 277-286 (2003).
- Shatil-Cohen, A., Attia, Z., Moshelion, M. Bundle-sheath cell regulation of xylem-mesophyll water transport via aquaporins under drought stress: a target of xylem-borne ABA?. The Plant Journal. 67, 72-80 (2011).
- Hachez, C., Moshelion, M., Zelazny, E., Cavez, D., Chaumont, F. Localization and quantification of plasma membrane aquaporin expression in maize primary root: A clue to understanding their role as cellular plumbers. Plant Molecular Biology. 62, 305-323 (2006).
- Hachez, C., Heinen, R. B., Draye, X., Chaumont, F. The expression pattern of plasma membrane aquaporins in maize leaf highlights their role in hydraulic regulation. Plant Molecular Biology. 68, 337-353 (2008).
- Besserer, A., et al. Selective regulation of maize plasma membrane aquaporin trafficking and activity by the SNARE SYP121. The Plant Cell. 24, 3463-3481 (2012).
- Moshelion, M., Moran, N., Chaumont, F. Dynamic changes in the osmotic water permeability of protoplast plasma membrane. Plant Physiology. 135, 2301-2317 (2004).
- Moshelion, M., et al. Membrane water permeability and aquaporin expression increase during growth of maize suspension cultured cells. Plant, Cell & Environment. 32, 1334-1345 (2009).
- Sade, N., et al. Improving plant stress tolerance and yield production: is the tonoplast aquaporin SlTIP2;2 a key to isohydric to anisohydric conversion?. New Phytologist. 181, 651-661 (2009).
- Volkov, V., et al. Water permeability differs between growing and non-growing barley leaf tissues. J. Exp. Bot. 58, 377 (2007).
- Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount. Plant Cell Reports. 21, 865-871 (2003).
- Hosy, E., Duby, G., Véry, A. A., Costa, A., Sentenac, H., Thibaud, J. B. A procedure for localisation and electrophysiological characterisation of ion channels heterologously expressed in a plant context. Plant Methods. 19, (2005).
- Shoseyov, O., Posen, Y., Grynspan, F. Human Recombinant Type I Collagen Produced in Plants. Tissue Eng Part A. 19, 1527-1533 (2013).
