Måling af Osmotisk Vand permeabilitetskoefficienten (P<sub> F</sub>) Af sfæriske celler: Isolerede planteprotoplaster som et eksempel
Summary
Måling af osmotiske koefficient vandpermeabiliteten (P f) af celler kan hjælpe med at forstå de regulatoriske mekanismer aquaporiner (AQPs). P f beslutsomhed i sfæriske plantecelleprotoplaster præsenteres her involverer protoplaster isolation og numerisk analyse af deres oprindelige sats på volumen forandring som følge af en osmotisk udfordring under konstant bad perfusion.
Abstract
Studere AQP reguleringsmekanismer er afgørende for forståelsen af vand relationer på både den cellulære og hele planten niveauer. Præsenteret her er en enkel og meget effektiv metode til bestemmelse af den osmotiske koefficient vandpermeabiliteten (P f) planteprotoplaster, der gælder i princippet også for andre sfæriske celler såsom frøoocyter. Det første trin i assayet er isolation af protoplaster fra plantevæv af interesse ved enzymatisk fordøjelse i et kammer med en egnet isotonisk opløsning. Det andet trin består af en osmotisk udfordring analyse: protoplaster immobiliseret på bunden af kammeret underkastes en konstant perfusion udgangspunkt med en isotonisk opløsning og efterfulgt af en hypotonisk opløsning. Cellen hævelsen er optages på video. I det tredje trin, vises billederne behandles offline for at give mængdemæssige ændringer, og tidsforløbet af ændringerne volumen er korreleret med tidsforløbet af ændringen i osmolakerhed af kammeret perfusionsmediet, ved hjælp af en kurve montering procedure skrevet i Matlab (den »PfFit«), for at give P f.
Introduction
Vandoptagelse og flowet over cellemembraner er en grundlæggende forudsætning for plante eksistens på både cellulær og hele planten niveauer. På celleniveau, aquaporiner (AQPs) spiller en central rolle i reguleringen af den osmotiske koefficient vandpermeabiliteten (P f) af cellemembranen 1-3.
Til dato har flere metoder blevet anvendt til at måle den endogene P f af protoplast fra forskellige planteorganer (dvs. rødder, mesophyll, endodermis etc., Revideret af Chaumont et al. 4). En af de metoder til at måle P f er at udsætte protoplasterne til en osmotisk udfordring og til at overvåge den oprindelige sats på sin ændring volumen (dvs.., Hældningen af den tidlige lineære fase af ændringen volumen). To forskellige metoder blev tidligere beskrevet baseret på denne fremgangsmåde, begge baseret på en øjeblikkelig udveksling af løsninger. Den første består af immobilizing protoplasten med en suge mikropipette og skifte vaskemiddeltilførslen 5 og den anden for at overføre protoplasten fra en løsning til en anden ved hjælp af en mikropipette 6. Disse mikropipette suge og mikropipette overføre metoder, som giver billedet erhvervelse ved starten af den hurtige løsning udveksling (for at fange den tidlige lineære fase af volumen forandring), sandsynligvis indebære en fysisk stress til protoplaster og kræver specialiseret udstyr og ekspert mikromanipulering.
Den her beskrevne metode minimerer forstyrrelse til cellerne, indebærer nogen mikromanipulering og tillader afledning af P-f, når badet perfusion ikke er øjeblikkelig.
Efter enzymatisk nedbrydning, protoplasterne, nedsænket i en isotonisk opløsning, immobiliseres på dækglasset glas bunden af en Plexiglas (alias Lucite eller plexiglas) kammer ved interaktion beregning. Derefter, under en konstant bad perfusionisotonisk opløsning skylles væk af en hypotonisk opløsning generere en hypoosmotisk udfordring protoplasterne. Hævelsen af protoplast er video registreres og derefter, ved at kombinere information om tidsforløbet for badet perfusion og tidsforløbet af cellen hævelse, er P f bestemmes ved billedbehandling og kurvetilpasningsteknikker procedurer.
Fordelene ved denne metode er, at forsøget er meget effektiv, dvs det er muligt at overvåge nogle celler samtidig i en enkelt analyse, og at det ikke kræver særligt udstyr eller særlig mikromanipuleringsmetoder færdigheder. Der er mulighed for flere ansøgninger for denne metode. For eksempel, bestemmelse af det native Pf af en række celler fra forskellige væv og planter, såsom mesophyll og samle kappe celler fra Arabidopsis blade 7, majs blad mesophyll eller root cortex celler 8-10 eller suspension dyrkede celler 11,12. I Additipå, er det muligt at bestemme Pf af sfæriske dyreceller såsom oocyt celler 11. Et andet eksempel involverer undersøgelse af AQP aktivitet ved forbigående ekspression af deres gen i protoplasterne (eller andre gener, der kan påvirke dem, fx, gener af kinaser) og bestemmelse af deres bidrag til P F; for eksempel ekspression af tomat AQP SlTIP2, 2 i Arabidopsis mesophyll protoplaster af PEG transformation og beslutsomhed for SlTIP2, 2-relateret P F 13. Endelig undersøgelse af effekten på P f forskellige molekyler / stoffer (lægemidler, hormoner, etc.) tilsat til løsninger kan også blive undersøgt, for eksempel af AQP blokker HgCl2 7.
Følgende protokol beskriver isoleringen af protoplaster af Arabidopsis mesofylceller og bestemmelse af deres Pf.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beskrevet her er en enkel og meget effektiv procedure til at måle P-f af isolerede planteprotoplaster, der gælder i princippet også for andre sfæriske celler, fx., Frøoocyter 11. Denne metode er baseret på at måle P f reaktion på en osmotisk udfordring til cellen. I modsætning til andre metoder baseret på denne fremgangsmåde er imidlertid, at ændringen af opløsninger, dvs af osmolariteten er ikke øjeblikkelig, men gradvis i løbet af en konstant bad perfus…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den belgiske nationale fond for Videnskabelige Forskningsråd (FNRS), Interuniversity Type polakker Program-belgisk politik for videnskab og "Communauté française de Belgique-actions de Recherches Concertées" til FC fra Israel Science Foundation Jerusalem ( ISF) til MM (Grant # 1311-1312), og til NM (Grant # 1312-1312).
Materials
| KCl | Chem-Impex International | 01247-1 | http://www.chemimpex.com Any source, anal. grade |
| CaCl2 | Merck | 11718006 | http://www.merck.com Any source, anal. grade |
| 2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES) | Sigma | 15152002 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| D-Sorbitol | Sigma | 18032003 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| Cellulase | Worthington, Lakewood, NJ, USA | LS002603 | http://www.worthingtonbiochem.com |
| Pectolyase | Karlan, Phonix, AZ, USA | 8006 | http://www.karlan.com |
| Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP) | Sigma | 81420 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9418-5G | http://www.sigmaaldrich.com |
| Protamine sulphate | Sigma | P4380 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Silicone vacuum grease heavy | Merck | 107921 | https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&SEO_ErrorPageOccurred=true&attachments=CoA |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100/TS100F | http://www.nikoninstruments.com |
| Peristaltic pump | BIO-RAD | EP-1 Econo Pump | http://www.bio-rad.com |
| Grayscale digital camera | Scion Corporation | CFW-1308M | http://www.scioncorp.com |
| CMU 1394 Camera Driver’ plugin for ImageJ | Carnegie Mellon | http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html Free software |
|
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ Free software |
|
| Econo Gradient Pump Fittings Kit | BIO-RAD | 731-9006 | http://www.bio-rad.com |
| Connectors, manifold | DirectMed | http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S | |
| Burette infusion sets (columns) | Welford | IF-BR-001 | http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61 |
| Tubing | TYGON | R-3603 | http://www.usplastic.com |
| Plexiglass slide etc. | Perspectiv | http://www.perspectiv.co.il/index-en.html Our slide was custom-made, it does not appear on the web site but a copy can be remade to order as 'a copy of the slide already made for M. Moshelion'. |
|
| 3M packaging Scotch tape 1'', clear | Viking Industrial, UK | VKMONO25 | http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8 any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK |
References
- Tyerman, S. D., Niemietz, C. M., Bramley, H. Plant aquaporins: multifunctional water and solute channels with expanding roles. Plant Cell Environ. 25, 173-194 (2002).
- Maurel, C. Plant aquaporins: Novel functions and regulation properties. Febs Letters. 581, 2227 (2007).
- Maurel, C., Verdoucq, L., Luu, D. T., Santoni, V. Plant aquaporins: Membrane channels with multiple integrated functions. Annual Review of Plant Biology. 59, 595 (2008).
- Chaumont, F., Moshelion, M., Daniels, M. J. Regulation of plant aquaporin activity. Biology Of The Cell. 97, 749-764 (2005).
- Ramahaleo, T., Morillon, R., Alexandre, J., Lassalles, J. P. Osmotic water permeability of isolated protoplasts. Modifications during development. Plant Physiology. 119, 885-896 (1999).
- Suga, S., Murai, M., Kuwagata, T., Maeshima, M. Differences in aquaporin levels among cell types of radish and measurement of osmotic water permeability of individual protoplasts. Plant Cell Physiol. 44, 277-286 (2003).
- Shatil-Cohen, A., Attia, Z., Moshelion, M. Bundle-sheath cell regulation of xylem-mesophyll water transport via aquaporins under drought stress: a target of xylem-borne ABA?. The Plant Journal. 67, 72-80 (2011).
- Hachez, C., Moshelion, M., Zelazny, E., Cavez, D., Chaumont, F. Localization and quantification of plasma membrane aquaporin expression in maize primary root: A clue to understanding their role as cellular plumbers. Plant Molecular Biology. 62, 305-323 (2006).
- Hachez, C., Heinen, R. B., Draye, X., Chaumont, F. The expression pattern of plasma membrane aquaporins in maize leaf highlights their role in hydraulic regulation. Plant Molecular Biology. 68, 337-353 (2008).
- Besserer, A., et al. Selective regulation of maize plasma membrane aquaporin trafficking and activity by the SNARE SYP121. The Plant Cell. 24, 3463-3481 (2012).
- Moshelion, M., Moran, N., Chaumont, F. Dynamic changes in the osmotic water permeability of protoplast plasma membrane. Plant Physiology. 135, 2301-2317 (2004).
- Moshelion, M., et al. Membrane water permeability and aquaporin expression increase during growth of maize suspension cultured cells. Plant, Cell & Environment. 32, 1334-1345 (2009).
- Sade, N., et al. Improving plant stress tolerance and yield production: is the tonoplast aquaporin SlTIP2;2 a key to isohydric to anisohydric conversion?. New Phytologist. 181, 651-661 (2009).
- Volkov, V., et al. Water permeability differs between growing and non-growing barley leaf tissues. J. Exp. Bot. 58, 377 (2007).
- Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount. Plant Cell Reports. 21, 865-871 (2003).
- Hosy, E., Duby, G., Véry, A. A., Costa, A., Sentenac, H., Thibaud, J. B. A procedure for localisation and electrophysiological characterisation of ion channels heterologously expressed in a plant context. Plant Methods. 19, (2005).
- Shoseyov, O., Posen, Y., Grynspan, F. Human Recombinant Type I Collagen Produced in Plants. Tissue Eng Part A. 19, 1527-1533 (2013).
