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Summary
Microdissection बड़े पैमाने पर ऊतक के भीतर डीएनए, आरएनए और प्रोटीन की परीक्षा के लिए नियोजित किया गया है. लेजर कब्जा माइक्रोस्कोपी (LCM) सबसे अधिक इस्तेमाल किया विधि है, लेकिन एक नए मिलिंग तकनीक, mesodissection, हाल ही में उपलब्ध है. हम mesodissected formalin तय आयल माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग granulomas के एम्बेडेड ऊतक स्लाइड से शाही सेना निकासी प्रदर्शित करता है.
Abstract
Microdissection एक दशक से अधिक समय के लिए डीएनए, आरएनए और प्रोटीन के स्तर पर ऊतकों की परीक्षा के लिए इस्तेमाल किया गया है. लेजर कब्जा माइक्रोस्कोपी (LCM) आज सबसे आम microdissection तकनीक है. इस तकनीक में, एक लेजर focally एक निर्जलित ऊतक धारा 1 overlies कि एक थर्माप्लास्टिक झिल्ली पिघला करने के लिए प्रयोग किया जाता है. ऊतक अनुभाग समग्र तब उठा लिया और झिल्ली से अलग है. इस तकनीक ऊतक परीक्षा के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया जा सकता है, यह समय लेने और महंगी है. इसके अलावा, इस तकनीक का उपयोग प्रक्रियाओं के सफल समापन के इस प्रकार इसके उपयोग को सीमित करने, एक लेज़र के उपयोग की आवश्यकता है. Mesodissection नामक एक नई और अधिक किफायती और व्यावहारिक microdissection दृष्टिकोण एलसीएम के नुकसान का समाधान संभव है. इस तकनीक मिल करने के लिए एक स्लाइड घुड़सवार ऊतक के नमूने से वांछित ऊतक MESO-1/MeSectr प्रणाली को रोजगार समवर्ती में वांछित ऊतक नमूना ठीक करने के लिए तरल पदार्थ वितरण और aspirating जबकिएक उपभोज्य मिल सा. विच्छेदन की प्रक्रिया शुरू होने के पहले उपयोगकर्ता (FFPE) एम्बेडेड formalin तय आयल (एच एंड ई) संदर्भ स्लाइड दाग एक hematoxylin और eosin साथ स्लाइड संरेखित करता है. इसके बाद ऑपरेटर वांछित विच्छेदन क्षेत्र annotates और उचित खंड काटना आय. कार्यक्रम विच्छेदन की एक संग्रहीत छवि उत्पन्न करता है. mesodissection का मुख्य लाभ यह है कि इस प्रयोग में पीढ़ी का नमूना देने के लिए सेट से दस मिनट की एक औसत लेने, एक स्लाइड टुकड़े करना करने के लिए आवश्यक कम अवधि है. साथ ही, सिस्टम काफी अधिक लागत प्रभावी और उपयोगकर्ता के अनुकूल है. एक मामूली नुकसान यह लेजर कब्जा माइक्रोस्कोपी के रूप में के रूप में सटीक नहीं है. इस लेख में हम mesodissection माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग (एमटीबी) के कारण FFPE granulomas से स्लाइड से शाही सेना को निकालने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि कैसे प्रदर्शित करता है.
Introduction
नमूने पारंपरिक रूप से मैन्युअल रूप से पूरे ऊतक या एक सुई और स्केलपेल का उपयोग कर स्लाइड या तो से microdissected किया गया है. यह ब्याज की ऊतक अनुभाग और आसपास के ऊतकों धारा 2 के बीच एक स्पष्ट विभाजन जरूरी है. आणविक रूपरेखा प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में वर्तमान प्रगति के साथ, सेलुलर स्तर पर ऊतक का आकलन करने के लिए एक बढ़ाने की जरूरत हुई है. कारण पुस्तिका microdissection की सीमाओं के कारण, एलसीएम सहित तकनीक अधिक से अधिक अलगाव सटीक अनुमति देने के लिए स्थापित किए गए थे. इस तकनीक शोधकर्ता तो ऐसे जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा के रूप में नीचे की ओर assays के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो विभिन्न सेल और स्लाइड प्रकार से विशिष्ट सेल आबादी, अलग करने के लिए अनुमति देता है. नीचे की ओर assays के लिए बहुत प्रभावी है, एलसीएम सीमाओं के बिना नहीं है. सबसे पहले, एलसीएम एक महंगी और समय लेने वाली प्रक्रिया है. इसके अतिरिक्त, शाही सेना के अस्थिर स्वभाव के कारण, यह अक्सर एलसीएम नमूने 2 से उच्च गुणवत्ता शाही सेना प्राप्त करने के लिए चुनौतीपूर्ण है. कारण आपदाओं कोएलसीएम की sadvantages, microdissection प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में नए अग्रिमों अभी भी एक किफायती और समय संवेदनशील ढंग से शोधकर्ताओं की एक बड़ी संख्या के लिए इसे और अधिक सुलभ बनाने के लिए आवश्यक हैं.
अब उपलब्ध microdissection प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में ऐसा ही एक उन्नति mesodissection रूप में जाना तकनीक है. इस तकनीक में एक मशीन मिल ब्याज की एनोटेट ऊतक अनुभाग के लिए प्रयोग किया जाता है और एक उपभोज्य मिल बिट 3 में यह रेस्पायरेट्रस. अगला, यह नमूना एक संग्रह ट्यूब में aspirated और बहाव के अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रणाली का लाभ यह काफी कम खर्चीला और समय संवेदनशील है कि कर रहे हैं. हमारे अनुभव में, सिस्टम दस मिनट में एक फेफड़ों ग्रेन्युलोमा ऊतक अनुभाग के विच्छेदन की अनुमति देता है. दूसरी ओर, पारंपरिक एलसीएम संभावना प्रक्रिया को पूरा करने के घंटे की आवश्यकता होगी. सिस्टम ऑपरेटर एनोटेशन के लिए एक तुलना के साथ ही उपकरण के रूप में उपयोग करने के लिए एक संदर्भ स्लाइड लोड करने के लिए अनुमति देता है. इसके अतिरिक्त एक रिपोर्ट रूपरेखा वें उत्पन्न होता हैविच्छेदित किया गया था कि स्लाइड की ई क्षेत्र. Mesodissection के लिए दो मुख्य नुकसान कर रहे हैं. एकाधिक कक्षों निकालने में कारगर है, यह एक एकल कोशिका को अलग करने की चुनौती दे रहा है. इसके अलावा, उत्पन्न छवि के सटीक अन्य इमेजिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग कर के रूप में अगर के रूप में स्पष्ट नहीं है.
क्षय रोग (टीबी) एक प्रमुख संक्रामक बीमारी दुनिया भर में मानवता का हत्यारा और एमटीबी के साथ संक्रमण का परिणाम है. एमटीबी की एयरोसौल्ज़ को उजागर व्यक्तियों के बहुमत में, संक्रमण गुप्त रूप से सीमित है. प्रतिवर्ष कम से कम 10 लाख लोगों में, यह सक्रिय टीबी रोग 4 में यह परिणाम है. अव्यक्त संक्रमण के दौरान, एमटीबी granulomas के रूप में जाना जाता रोग फेफड़ों के घावों के भीतर निहित है. इसलिए यह एमटीबी संक्रमण के परिणाम ग्रेन्युलोमा 5 के स्तर पर निर्णय लिया जाता है कि तर्क दिया गया है.
यहाँ हम mesodissection एमटीबी के कारण granulomas microdissect करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि कैसे प्रदर्शित करता है. इस्तेमाल किया स्लाइड्ससंक्रमित रीसस मकाक से FFPE फेफड़े के ऊतकों से कर रहे हैं. इस प्रदर्शन के प्रयोजन के लिए, हम अपनी संपूर्णता में granulomas काटना होगा. हम भी शाही सेना बरामद ऊतकों से निकाला जा सकता है कि प्रदर्शित करता है. इस तकनीक को विभिन्न अन्य नमूनों से ऊतकों के नमूनों के लिए आवेदन किया और फिर नीचे की ओर assays के एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
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Protocol
2iD इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ 1. जांचना Mesodissection साधन
2iD इमेजिंग सॉफ्टवेयर इस आलेख के शेष के लिए सॉफ्टवेयर या कार्यक्रम या तो के रूप में करने के लिए भेजा जाएगा. इस कदम को सही ढंग से छवि को ट्रैक करने के साथ ही कई स्लाइड फ्रेम संरेखित करने की जरूरत है.
- साधन और कंप्यूटर पर मुड़ें.
- ओपन सॉफ्टवेयर और "जांचना साधन" का चयन करें.
- जॉयस्टिक का उपयोग करके मंच यात्रा जांचना. ऊपरी बाएँ स्थिति को मंच पर ले जाएँ. कार्यक्रम में चरण 1 के तहत प्रेस "सेट".
- सही स्थिति को कम करने के लिए मंच ले जाएँ. कार्यक्रम में चरण 2 के तहत प्रेस "सेट".
- पहले सिर विधानसभा जुटाने के लिए "जेड" बटन दबाकर आकांक्षा जांचना. जॉयस्टिक पर प्रेस "महाप्राण पल्स" बटन और "विच्छेदन" बटन सवार नियंत्रण रॉड जब तक शीर्ष स्थान तक पहुँच जाता है. कार्यक्रम के चरण 3 के तहत प्रेस "सेट".
- प्रेस "महाप्राण रीसेट और# 8221; बटन. सवार चरण 4 में नीचे की स्थिति प्रेस "सेट" पर रुक जाता है एक बार.
- "पैमाने टैब" पर क्लिक करें.
- रिक्त ओर अंशांकन शासक रखें.
- अगर जरूरत खुर्दबीन ध्यान दें.
- माउस का प्रयोग कर दो स्केल सलाखों के बीच रेखा खींचने.
- चरण 2. प्रेस "गणना" बटन लेबल बॉक्स में दूरी दर्ज करें.
- "Crosshair" टैब पर क्लिक करें. 1 मोटर गति मुड़ें.
- सिर विधानसभा में xScisor डालें. "Z-अक्ष" बटन दबाने से z-अक्ष तैयार स्थिति में निचले सिर विधानसभा. नोट: सिर विधानसभा शीर्ष विच्छेदन साधन पर बड़ी संरचना है. xScisor इस आलेख के शेष के लिए एक उपभोज्य मिल बिट के रूप में करने के लिए भेजा जाएगा.
- जॉयस्टिक पर बटन "विच्छेदन संलग्न" पर क्लिक करें. नोट: इस बटन को जॉयस्टिक की चोटी पर स्थित है.
- नेत्रहीन रोटेशन के केंद्र परिभाषित करें. ऐसा करने के लिए, परिभाषित का उपयोग कर रोटेशन के केंद्र पर crosshair के केंद्र के लिए कदमकार्यक्रम के चरण 1 में डी पैरामीटर. Crosshair संरेखित करने के लिए पिक्सल को समायोजित करने के लिए "X" और "Y-अक्ष" सलाखों में ऊपर और नीचे तीर का प्रयोग करें. "किया" टैब पर क्लिक करें.
- "होम" आइकन पर क्लिक करें. नोट: यह ऊपरी दाएँ हाथ के कोने में स्थित एक घर छवि का प्रतिनिधित्व करती है.
2. संदर्भ छवि बनाएँ
- मंच पर एच ई स्लाइड रखें. स्लाइड के शीर्ष पर अपारदर्शी कवर रखें. एच एंड ई स्लाइड के वांछित क्षेत्र के लिए जॉयस्टिक ले जाकर साधन ड्राइव. उत्पन्न छवि को बचाओ. नोट: "कब्जा संदर्भ" टैब या "काटना" टैब या तो इस चरण को पूरा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
3. विच्छेदन के लिए ऊतक संरेखित
- होम स्क्रीन पर "ऊतक काटना" विकल्प पर क्लिक करें.
- "ऑपरेटर," "विच्छेदन परिग्रहण संख्या," "संदर्भ परिग्रहण संख्या," "xScisor बारकोड नंबर," & # भरें8220; विच्छेदन तरल पदार्थ बहुत संख्या, "" xScisor आकार "और" सेटअप "टैब में" वर्णन ".
- "ऊतक खोजने के लिए" टैब पर क्लिक करें.
- आयात पहले से संदर्भ छवि को बचाया.
- मंच पर 5 माइक्रोन मोटाई के एक बेदाग FFPE स्लाइड रखें. संदर्भ छवि में दिखाया गया एक के रूप में एक ही क्षेत्र के लिए मंच ले जाएँ. "छवि डालें" टैब पर क्लिक करें.
- "Align" टैब पर क्लिक करें. बेदाग छवि के संदर्भ छवि को संरेखित करने के लिए माउस और एसोसिएटेड तीर का प्रयोग करें.
4. स्लाइड एनोटेट
- "व्याख्या" टैब पर क्लिक करें.
- Microdissected किया जाएगा कि स्लाइड के वांछित क्षेत्र के चारों ओर एक चक्र आकर्षित करने के लिए माउस का प्रयोग करें.
5. उपभोज्य मिल बिट लोड
- एक द्रव गति में ऊपर और नीचे कई बार सवार खींच कर, यहां वांछित बफर, PKD बफर के साथ उपभोज्य मिल सा भरें. यकीन है कि हवा को बाहर निकालने के लिए करेंबुलबुले.
- "Z-अक्ष बटन" दबाने से Z-अक्ष उठाएँ.
- मशीन में उपभोज्य मिल सा लोड करें. मशीन के शीर्ष में उपभोज्य मिल सा फिसलने से यह इतना है कि उपभोज्य मिल बिट पर काला लाइन के साथ साधन तर्ज पर सफेद लाइन. सवार सही स्थिति में उतारा जा करने के लिए अनुमति देने के लिए प्रेस "आकांक्षा रीसेट" बटन. नोट: यह उपभोज्य मिल सा स्लाइड करने के लिए आसान होना चाहिए. यदि ऐसा नहीं है, notches के सही ढंग से गठबंधन कर रहे हैं सुनिश्चित करें.
- फिर "z-अक्ष" बटन दबाने से लोअर Z-अक्ष.
6. ऊतक काटना (चित्रा 4)
- "काटना" टैब खोलें.
- 1 के लिए मोटर और आकांक्षा गति मुड़ें.
- "शो ट्रैकिंग" बॉक्स की जाँच करें. नोट: इस उपयोगकर्ता विच्छेदन की प्रक्रिया के दौरान विच्छेदित क्षेत्र कल्पना करने के लिए अनुमति देता है.
- काटना एक बार तैयार, बटन "संलग्न" के साथ ही "महाप्राण & # पकड़ जारी8221; बटन ऊतक काटना एक वामावर्त दिशा में जॉयस्टिक जब चलती है.
- महाप्राण "पूरा" टैब लाल हो जाता है जब तक एक वामावर्त दिशा में काटना जारी.
7. उपभोज्य मिल बिट खाली और निकालें
- उपभोज्य मिल बिट की नोक के तहत एक 0.5 μl microfuge ट्यूब रखें.
- प्रेस "आकांक्षा" नियंत्रण रॉड जल्दी microfuge ट्यूब में नमूना बेदखल करने के लिए.
- खेतों में उपभोज्य मिल सा बेदखल करने के लिए वृद्धि हुई शक्ति के साथ प्रेस.
- सवार वापस खींच कर ऊतक टुकड़ा कुल्ला. उपभोज्य मिल बिट में शेष नमूना व्यक्त करने के लिए आगे सवार धक्का. ऊतक टुकड़ा अब microfuge ट्यूब के भीतर समाहित किया जाएगा.
गर्मी उपचार के बाद proteinase कश्मीर पाचन के साथ 8. Lyse नमूना
- ऊतक नमूना बरामद करने proteinase कश्मीर की 5 ग्राम युक्त 70 μl ते 8.5 पीएच जोड़ें.
- प्रोग्राम हीटर-प्रकार के बरतन में नमूना रखें.
- निम्नलिखित सेटिंग में प्रोग्राम हीटर-प्रकार के बरतन का उपयोग पूर्ण पाचन: 1,500 rpm पर 30 मिनट के लिए 60 ˚ सी; 1500 rpm पर 15 मिनट के लिए 82 ˚ सी; और 450 rpm पर 1 मिनट के लिए 25 ˚ सी. नमूना अब बहाव के अनुप्रयोगों के लिए तैयार है.
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Representative Results
aforementioned प्रोटोकॉल FFPE ऊतक स्लाइड से शाही सेना को निकालने के लिए एक नया mesodissection तकनीक का उपयोग करने के लिए दिखाता है. इस प्रोटोकॉल की प्रभावकारिता विभिन्न संक्रामक चरणों में एमटीबी से संक्रमित NHP से फेफड़ों granulomas की FFPE स्लाइड के माध्यम से दिखाया गया है. 1-3 साधन. चित्रा 4 के चित्र हैं आंकड़े विच्छेदन प्रक्रिया होती है कि कैसे दर्शाया गया है और सॉफ्टवेयर. तालिका 1 द्वारा उत्पन्न परिणामस्वरूप छवि प्रत्येक संक्रामक राज्य में एक NHP से एक ग्रेन्युलोमा साथ शाही सेना निकासी के परिणामों से पता चलता है. शाही सेना प्रवर्धित और -16 (टेबल्स 2-4) के RT-पीसीआर सबूत के लिए अनुमति देने के लिए शुद्ध किया गया था. तालिका 4 इस प्रकार एमटीबी ribosomal सबयूनिट -16 की उपस्थिति की पुष्टि, और एमटीबी, microdissected नमूनों में.
जॉयस्टिक सहित mesodissection साधन के 1. छवि चित्रा. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 2. Mesodissection साधन के करीब देख. "Z-अक्ष" बटन, "मोटर" गति और "आकांक्षा" गति knobs छवि के बाईं ओर दिखाई जाती हैं. "वातशोषक रीसेट बटन" और "पर / बंद" बटन छवि के दाईं ओर दिखाई जाती हैं. स्लाइड चरण साधन के शीर्ष पर है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 3. जॉयस्टिक के करीब देख. जॉयस्टिक, "महाप्राण पल्स" और दिखाया "मंच गति" बटन. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
NHP EB23 से mesodissected पूरे ग्रेन्युलोमा की चित्रा 4. रिपोर्ट. इस अध्ययन में प्रयुक्त जानवर एयरोसोल के माध्यम से CDC1551 एमटीबी से संक्रमित थे. बाईं तरफ संदर्भ छवि एक सक्रिय रूप से संक्रमित रीसस मकाक से एक एच ई कलंकित ग्रेन्युलोमा से पता चलता है. विच्छेदित किए जाने की रुचि के वांछित क्षेत्र हरे रंग में उल्लिखित है. मध्य थानेदार में छविWS विच्छेदन से पहले 5 माइक्रोन मोटाई की इसी बेदाग FFPE स्लाइड. क्षेत्रों सॉफ्टवेयर का उपयोग गठबंधन किया गया है और ब्याज की correlating क्षेत्र हरे रंग में उल्लिखित है. सही पर छवि एक ही बेदाग FFPE स्लाइड पद विच्छेदन को दर्शाया गया है. विच्छेदित क्षेत्र नीले रंग में प्रस्तुत किया जाता है. एक 400 मिमी 2 उपभोज्य मिल बड़ा सा विच्छेदन क्षेत्र के लिए माध्यम के पार विच्छेदन के लिए बनाया गया है जो विच्छेदन के लिए इस्तेमाल किया गया था. बड़े विच्छेदन क्षेत्र कम से कम 100 मिमी 2 के रूप में वर्णन किया गया है. अन्य क्षेत्रों / विच्छेदन प्रकार के लिए डिजाइन आकारों में उपलब्ध हैं. रिपोर्ट 0 मिमी 2 के रूप में एनोटेट क्षेत्र का वर्णन करता है, यह गलत है. हम मशीन से microdissected स्लाइड हटाने और शारीरिक रूप से ब्याज के ही क्षेत्र में जब देखो, हम अब ऊतक है और इसलिए विच्छेदित कर दिया गया है कि स्लाइड पर इसी क्षेत्र को देख सकते हैं. यह लेखकों साधन किराये पर लिया है कि ध्यान दिया जाना चाहिए और इस मुद्दे पर अन्य instrume पर तय किया गया हैएनटीएस. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
| रहनुमा | संक्रामक राज्य | एनजी / μl में शाही सेना एकाग्रता | एनजी में कुल शाही सेना | 260/280 | 260/230 |
| EB23 | सक्रिय | 48.3 | 724.5 | 1.71 | 1.59 |
| HB12 | अव्यक्त | 61.4 | 921 | 1.7 | 1.86 |
| HP41 | SIV के साथ सह संक्रमण के माध्यम से फिर सक्रिय | 22.3 | 334.5 | 1.9 | 2.18 |
तालिका 1. शाही सेना सांद्रता निकासी के बाद. नमूना DNAsed गया था और शाही सेना निकासी Qiagen RNAeasy FFPE किट का उपयोग किया गया था. शाही सेना चोरcentration एक NanoDrop का उपयोग कर प्राप्त किया गया था. NHP संक्रामक चरणों भी चित्रित कर रहे हैं. शाही सेना के 15 μl RNase मुफ्त पानी में eluted था.
| रहनुमा | संक्रामक राज्य | एनजी / μl में सीडीएनए एकाग्रता | एनजी में कुल सीडीएनए | 260/280 | 260/230 |
| EB23 | सक्रिय | 31.7 | 951 | 2.08 | 2.37 |
| HB12 | अव्यक्त | 156.5 | 4695 | 1.94 | 4.4 |
| HP41 | SIV के साथ सह संक्रमण के माध्यम से फिर सक्रिय | 41.7 | 1251 | 2.19 | 3.44 |
तालिका 2. सीडीएनए सांद्रता प्रवर्धन और शोधन के बाद. NHP संक्रामक चरणों भी चित्रित कर रहे हैं. शाही सेना तालियाँ आरएनए Seq FFPE प्रणाली (पार्ट टाइम का उपयोग परिलक्षित किया गया थाओ. 7150) और प्रवर्धित सीडीएनए परिणामस्वरूप प्रवर्धन प्रणाली के उपयोगकर्ता पुस्तिका के पृष्ठ 26 पर NuGEN ने सुझाव दिया है QIAGEN QIAquick पीसीआर शोधन किट का उपयोग कर शुद्ध किया गया. सीडीएनए 30 μl ते बफर में eluted था.
| अच्छी तरह से | रिपोर्टर | सीटी | टीएम मूल्य |
| -16 10-1 | मानक | 12.35138 | 79.4 |
| -16 10-2 | मानक | 16.144611 | 79.4 |
| -16 10-3 | मानक | 17.911345 | 79.4 |
| -16 10-4 | मानक | 21.762596 | 79.4 |
| -16 10-5 | मानक | 25.746624 | 79.4 |
| -16 10-6 | मानक | 28.505266 | 79.1 |
| HB12 | अज्ञात 25.771492 | 77.8 | |
| HP41 | अज्ञात | 17.760149 | 78 |
| EB23 | अज्ञात | 24.754618 | 78.2 |
| नकारात्मक नियंत्रण | एनटीसी | 33.544422 | 79.7 |
तालिका 3. आरटी पीसीआर -16 के संबंध ribosomal सबयूनिट के साथ परिणाम है. इस प्रकार के नमूने के भीतर एमटीबी की मौजूदगी साबित मनाया उपयुक्त प्रवर्धन. CDC1551 तनाव एमटीबी से जीनोमिक डीएनए एक मानक के रूप में इस्तेमाल किया गया था.
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Discussion
Mesodissection रोगजनकों की एक विशाल सरणी की वजह से वैकृत घाव स्लाइड से शाही सेना निकासी के लिए लागू किया जा सकता है कि एक तकनीक है. यह उपयोगकर्ता छवि पटरियों और सही ढंग से छवि संरेखित करता है कि एक जरूरत है. इसे पूरा करने के साधन इमेजिंग सॉफ्टवेयर पर निर्देशों का पालन calibrated किया जाना चाहिए. विदारक जब विच्छेदित किया जा रहा है ब्याज की स्लाइड और क्षेत्र संरेखित नहीं करते हैं, तो उपयोगकर्ता साधन recalibrate चाहिए. विच्छेदन की प्रक्रिया में एक और महत्वपूर्ण कदम यह पिछले विच्छेदन (5.1 कदम) के लिए बुलबुले से रहित है कि इस तरह के एक तरीके से उपभोज्य मिल सा लोड करने के लिए है. हम बुलबुले की उपस्थिति विच्छेदन उपज कम हो जाती है कि मिल गया है. इस समस्या को दूर करने के लिए हम कई बार पहुंचा और सवार व्यक्त की सलाह देते हैं. उपयोगकर्ता निर्माता की सिफारिश के अनुसार, बुलबुले कल्पना करने के लिए एक अभ्यास बफर करने के लिए रंग भोजन जोड़कर इस अभ्यास कर सकते हैं. प्रभावी बार, उपयोगकर्ता तो सामान्य विच्छेदन के साथ आगे बढ़ना चाहिए. लासेंट महत्वपूर्ण कदम एक वामावर्त दिशा में नमूना काटना है. एक वामावर्त दिशा में मशीन मिलों; इसलिए, हम एक वामावर्त ढंग से एक परिपत्र गति में जॉयस्टिक आगे बढ़ अधिक सफाई से अनुगामी किनारे 6 से अग्रणी धार में कटौती के रूप में ऊतक पैदावार बढ़ जाती है कि मिल गया है. ऊतक उपज में सुधार करने के लिए एक और रास्ता विच्छेदन की प्रक्रिया की गति को कम करने के लिए है. हम एक साथ "कम" उच्चतम ऊतक उपज का उत्पादन करने के लिए मंच गति सेट करते समय सबसे कम गति पर आकांक्षा दर और मोटर गति सेटिंग है कि मिल गया है. इस microdissection दृष्टिकोण के लिए दो मुख्य सीमाएं हैं. पहले सीमा हम कारण विच्छेदन की प्रक्रिया में वामावर्त हलकों में जॉयस्टिक ड्राइव करने की आवश्यकता को इंगित विच्छेदन बहुत चुनौतीपूर्ण पाया है. दूसरी सीमा साधन पर कैमरा एक उन्नत खुर्दबीन से उत्पन्न एक छवि के सेलुलर विस्तार का अभाव है कि एक छवि उत्पन्न करता है.
एमटीबी की transcriptomic विश्लेषण करने के लिए सम्मान के साथ सीधा प्रभाव पड़ता है. ग्रेन्युलोमा गठन टीबी संक्रमण और फेफड़ों 5 के एक सीमित क्षेत्र के भीतर रोगज़नक़ रोकने के लिए मेजबान के प्रयास से परिणामों की एक बानगी है. इसके विपरीत, यह एमटीबी. एमटीबी संक्रमण की अवस्था के आधार पर विभिन्न तनावों के अधीन है granulomatous घावों 7 में अपने हठ अनुमति देने के लिए विकसित किया गया है कि प्रस्तावित किया गया है. इन तनावों से कुछ में शामिल हैं लेकिन आदि 7-13 redox तनाव, कम पीएच, झिल्ली क्षति, हाइपोक्सिया, पोषण की कमी, तक सीमित नहीं हैं. इन विभिन्न चरणों के दौरान, एमटीबी अभी भी एक अव्यक्त रूप में जीवित रहते हैं और यहां तक कि पुन: सक्रिय कर सकते हैं. यह अलग जीन upregulated और विभिन्न संक्रामक चरणों में downregulated रहे हैं कि इसका मतलब है. उदाहरण के लिए, एमटीबी 200 से अधिक प्रतिलेखन कारक 4 encodes. इसके अलावा, यह अलग chemokines के बीच अभिव्यक्ति संतुलन, सफलता दिखाया गया है किग्रेन्युलोमा भीतर α और β chemokines, के रूप में घंटे महत्वपूर्ण सुरक्षा मार्कर 8 हो सकता है. Granulomatous के ऊतकों में माइक्रोबैक्टीरियल transcriptomics का मूल्यांकन संक्रमण के प्रत्येक राज्य में व्यक्त कर रहे हैं कि उनके निर्माण में शामिल तंत्र और रखरखाव के साथ ही उन जीनों के बारे में हमारी समझ को आगे जाने की संभावना है. यह हमें, सक्रिय अव्यक्त और फिर सक्रिय रोग के साथ ही ग्रेन्युलोमा के भीतर ही विभिन्न क्षेत्रों सहित विभिन्न टीबी संक्रामक चरणों में माइक्रोबैक्टीरियल transcriptomics का मूल्यांकन करने की अनुमति देगा. हमें आगे माइक्रोबैक्टीरियल transcriptomics का आकलन करने के लिए अनुमति के अलावा, उपरोक्त प्रक्रिया भी एक ही संक्रामक राज्यों में मेजबान transcriptomics के आकलन के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, इस दृष्टिकोण तो मेजबान और बैक्टीरिया के बीच संबंध, तुलना विपरीत है, और विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
टीबी अनुसंधान के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण उपकरण है, aforementioned प्रोटोकॉल के रूप में अच्छी तरह से अन्य रोगजनकों के लिए लागू किया जा सकता है. ऊपरप्रोटोकॉल संक्रमित फेफड़ों के नमूनों से FFPE स्लाइड्स का उपयोग करता है, लेकिन यह भी अन्य अंगों से घावों के लिए लागू किया जा सकता है. हम शाही सेना को निकालने के लिए इस प्रणाली का उपयोग करने के लिए प्रदर्शन, लेकिन यह सैद्धांतिक रूप से एक समान रूप से प्रभावी और समय संवेदनशील ढंग से डीएनए और प्रोटीन निकासी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. FFPE ब्लॉकों सबसे प्रयोगशाला ऊतक विज्ञान विभागों में उपलब्ध हैं; इसलिए, यहाँ वर्णित तकनीक तेजी से इन वर्तमान में अप्रयुक्त नमूनों से प्राप्त ज्ञान में वृद्धि की संभावना है.
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Disclosures
लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों है कि वहाँ का खुलासा.
Acknowledgments
R01HL106790, R01HL106790-S1, R01HL106786, R01AI089323, R21AI091457, R21RR026006, P20RR020159, C06RR017563, 8T32OD011124-08, और P51OD011104: लेखक इस शोध के समर्थन के लिए निम्नलिखित एनआईएच पुरस्कार / subawards स्वीकार करना चाहते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MeSectr | AvanSci Bio | Mesodissector | |
| 400 nm xScisors | AvanSci Bio | Other sizes available | |
| THOR | AvanSci Bio | Programmable Heater-Shaker | |
| NanoDrop2000 | ThermoScientific | ND-2000 | |
| RNeasy FFPE extraction kit | Qiagen | 73504 | |
| Ovation RNA-Seq FFPE System | Nugen | 7150 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 |
References
- Fend, F., Raffeld, M.
- Esposito, G. Complementary techniques: laser capture microdissection--increasing specificity of gene expression profiling of cancer specimens. Adv Exp Med Biol. 593, 54-65 (2007).
- Adey, N., Bosh, D., Emery, D., Birch, L., Parry, R. Mesodissection of Paraffin Embedded Slide Mounted Tissue Sections. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (6), (2012).
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इम्यूनोलॉजी अंक 88 Microdissection mesodissection formalin तय आयल एम्बेडेड,Erratum
Formal Correction: Erratum: A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas
Posted by JoVE Editors on 07/01/2014.
Citeable Link.
The corresponding author was changed for the article, A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas. The corresponding author was changed from:
Teresa A. Hudock
to:
Deepak Kaushal
