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Summary
顕微解剖は、広範囲の組織内のDNA、RNA、およびタンパク質の試験のために使用されている。レーザーキャプチャー顕微鏡（LCM）は、最も一般的に使用される方法ですが、新しい製粉技術、mesodissectionは、最近になって提供されています。私たちは、 結核菌肉芽腫の組織スライドを組み込みmesodissectedホルマリン固定パラフィンからのRNA抽出を示しています。
Abstract
顕微解剖は、10年以上にわたってDNA、RNA、およびタンパク質レベルでの組織の検査のために使用されている。レーザーキャプチャー顕微鏡（LCM）は本日、使用される最も一般的なマイクロダイセクション法である。この技術では、レーザーは、局所的に脱水された組織部1の上に重なる熱可塑性膜を溶融するために使用される。組織切片複合体は、その後持ち上げられ、膜から分離される。この技術は、組織検査のために首尾よく使用することができるが、それは時間がかかり、高価である。さらに、この技術を用いる手順が正常に完了し、したがって、その使用を制限する、レーザの使用を必要とする。 mesodissectionと呼ばれる新しい、より手頃な価格で実用的な顕微解剖法は、LCMの落とし穴に可能な解決策である。この技術は、ミルに取り付けられたスライド組織試料から所望の組織をMESO-1/MeSectr方式を採用し、同時に中に所望の組織試料を回収するための流体を分配し、吸引しながら消耗旋削ビット。解剖プロセスが始まる前に、ユーザは（FFPE）ホルマリン固定パラフィン包埋染色、ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）参照スライド摺動整列する。その後、オペレータは、所望の解剖領域に注釈し、適切なセグメントを解剖に進む。プログラムは、解剖のアーカイブされた画像を生成する。 mesodissectionの主な利点は、この実験で世代をサンプリングするように設定から10分の平均を取って、スライドを分析するのに必要な短い期間です。さらに、システムを大幅に、より効果的なコストで使いやすいです。わずかな欠点は、レーザーキャプチャー顕微鏡法ほど正確ではないことである。この記事では、mesodissectionは、FFPEからのスライドからRNAを抽出するために使用する方法を示し結核菌（MTB）に起因する肉芽腫。
Introduction
サンプルは、伝統的に手動で針とメスを用いて、全組織またはスライドのいずれかから顕微解剖されています。これは、対象の組織切片と周囲の組織切片2との間に明確な分離を必要とする。分子プロファイリング技術の現在の進歩により、細胞レベルで組織を評価する必要性が高まってきた。により手動マイクロダイセクションの制限のため、LCMを含む技術が高いアイソレーションの精度を可能にするために設立された。この技術は、研究者は、そのような遺伝子発現プロファイリングのような下流アッセイのために使用することができる様々な細胞及びスライド型から特定の細胞集団を単離することができる。ダウンストリームアッセイのために非常に効果的ではあるが、LCMには限界がないわけではない。まず、LCMは、高価で時間のかかるプロセスである。さらに、RNA起因の不安定な性質のために、それは多くの場合、LCM試料2から高品質のRNAを得るために挑戦している。ディによるLCMのsadvantagesは、マイクロダイセクション技術の新たな進歩はまだ手頃な価格と時間に敏感な方法で、研究者がより多くのことをよりアクセシブルにするために必要です。
利用できるようになりまし顕微解剖技術の一つは、このような進歩は、mesodissectionとして知られている技術である。この技術では、機械は工場に関心のある注釈付き組織切片を使用し、消耗品の旋削ビット3にそれを吸引する。次に、このサンプルは、収集チューブ内に吸引し、下流の用途に使用することができる。このシステムの利点は、それが大幅に少ない費用と時間が敏感であることである。我々の経験では、システムは10分で肺肉芽腫組織切片の解剖を可能にします。一方、伝統的なLCM可能性が高いプロセスを完了するために時間が必要となる。このシステムは、オペレータが比較だけでなく、注釈のためのツールとして使用するために、参照スライドをロードすることができます。さらに報告書はアウトライン番目に生成されます解剖したスライドのEエリア。 mesodissectionするには2つの主な欠点があります。複数のセルを抽出するのに有効であるが、単一細胞を単離するために挑戦している。また、生成された画像の精度は他のイメージング顕微鏡を使用している場合ほど明確ではありません。
結核（TB）は、世界中の人間性とマウンテンバイクでの感染からの結果の主要な感染症キラーです。 マウンテンバイクのエーロゾルに暴露された個人の大半では、感染は潜伏限られている。毎年少なくとも10万人では、活動性結核4になる。潜伏感染時に、 マウンテンバイクは、肉芽腫として知られている病的な肺病変の中に含まれている。そのためには、 マウンテンバイクの感染の結果は肉芽腫5のレベルで決定されていると主張してきた。
ここでは、mesodissectionはマウンテンバイクに起因する肉芽腫を顕微解剖するために使用することができる方法を示します。スライドを使用感染したアカゲザルからのFFPE肺組織からのものである。このデモの目的のために、我々は、その全体が肉芽腫を分析します。我々はまた、RNAを回収した組織から抽出することができることを実証している。この技術は、様々な他の標本から組織サンプルに適用し、次いで、下流の種々のアッセイのために使用することができる。
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Protocol
2IDイメージングソフトウェアを使用した1。校正Mesodissectionインストゥルメント
2IDイメージングソフトウェアは、この記事の残りの部分のためのソフトウェアまたはプログラムのどちらかと呼ぶことにする。このステップは、画像を正しく追跡するだけでなく、複数のスライドフレームを整列するために必要とされる。
- 測定器とコンピュータの電源を入れます。
- オープンなソフトウェアと「校正器」を選択します。
- ジョイスティックを使用して、ステージの移動を校正します。左上の位置にステージを移動します。プログラムのステップ1の下を押して「SET」。
- 右の位置を下げるために、ステージを移動します。プログラムのステップ2の下を押して「SET」。
- 第1ヘッドアセンブリを上げるために「Zボタン」を押すことにより吸引を校正します。ジョイスティックを押して「吸引パルス」ボタンと「解剖」ボタンを押すと、プランジャー、制御棒までトップの位置に到達する。プログラムのステップ3の下を押して「SET」。
- を押して「吸引リセット＆＃8221;ボタンを押します。プランジャーは、ステップ4の一番下の位置を押して「SET」で停止したら。
- 「スケールタブ」をクリックします。
- 空白の側でキャリブレーション定規を置きます。
- 必要に応じて、顕微鏡の焦点を合わせる。
- マウスを使用して2のスケールバーの間に線を描画します。
- ステップ2。を押して「計算」ボタンラベルのボックスに距離を入力します。
- 「十字線」タブをクリックします。 1にモータ速度をオンにします。
- ヘッドアセンブリにxScisorを挿入します。 「z軸」ボタンを押すことにより、z軸準備位置に下部ヘッドアセンブリ。注：ヘッドアセンブリは、トップ解剖機器に大きな構造体である。 xScisorは、この記事の残りの部分のための消耗品旋削ビットと呼ぶことにする。
- ジョイスティックのボタンを「解剖がかみ合う」をクリックしてください。注：このボタンは、ジョイスティックの上に位置しています。
- 視覚的に回転の中心を定義します。これを行うには、定義を用いて、回転の中心に十字の中心を移動するプログラムのステップ1においてdパラメータ。十字線を整列させるためにピクセルを調整するために、「X」と「Y軸」のバーで上下の矢印を使用してください。 「完了」タブをクリックします。
- 「ホーム」アイコンをクリックしてください。注：これは、右上隅に位置して家の画像で表されます。
2。参照イメージを作成
- ステージ上でのH＆Eスライドを置きます。スライドの上に不透明のカバーを置きます。 H＆Eスライドの所望の領域にジョイスティックを移動することで、機器を駆動します。生成された画像を保存します。注：「捕獲リファレンス」タブまたは「解剖」タブのいずれかが、この手順を完了するために使用することができます。
3。解剖のための組織の位置を合わせます
- ホーム画面の「組織を切開」オプションをクリックします。
- 「演算子」「解剖受託番号」「参照アクセッション番号」「xScisorのバーコード番号、「＆＃必要事項を記入8220;解剖流体ロット番号」「xScisorサイズ」と「設定」タブ内の「説明」。
- 「組織の検索」タブをクリックします。
- インポートは、以前に参照画像を保存した。
- ステージ上で5ミクロンの厚さの無染色のFFPEスライドを置きます。基準画像に描かれたものと同じエリアにステージを移動します。 「イメージの挿入」タブをクリックします。
- 「ALIGN」タブをクリックします。染色されていない画像を参照画像を位置合わせするために、マウスと関連する矢印を使用してください。
4スライドに注釈を付ける
- 「注釈」タブをクリックします。
- 顕微解剖され、スライドの所望の領域の周りに円を描くようにマウスを使用しています。
5。消耗旋削ビットのロード
- 流体の動きで上下に数回、プランジャーを引いて、ここでは必要なバッファー、PKDバッファーで消耗旋削ビットを埋める。空気を除外するようにしてください泡。
- 「Z軸ボタン」を押すことにより、Z軸を上げます。
- マシンに消耗旋削ビットをロードします。機械の上部に消耗旋削ビットをスライドさせて、これを行うことにより、消耗品の旋削ビット上の黒線で最大の機器のラインに白いライン。プランジャが正しい位置に下げることができるように押して、「吸引リセット」ボタンを押します。注：消耗旋削ビットをスライドさせて簡単にする必要があります。そうでない場合は、ノッチが正しく整列していることを確認してください。
- 再度「Z軸」ボタンを押すことによりZ軸低級。
6。組織を切開します（ 図4）
- 「解剖」タブを開きます。
- 1モータ及び吸引速度をオンにします。
- 「ショーの追跡」チェックボックスをオンにします。注：これは、ユーザが切開プロセス中に解剖領域を可視化することを可能にする。
- 解剖する準備ができたら、ボタンを「従事」だけでなく、「吸引＆＃保持し続け8221;ボタン組織を切開するために反時計方向にジョイスティックを移動しながら。
- 吸引は、「フル」タブが赤くなるまで反時計方向に解剖し続ける。
7。消耗旋削ビットを空にして削除
- 消耗旋削ビットの先端の下に0.5μlのマイクロチューブを配置します。
- を押して「吸引」制御棒はすぐにマイクロチューブにサンプルを取り出します。
- 使用済み消耗品の旋削ビットを排出するために増加の力で押します。
- バックプランジャーを引いて組織片を洗浄します。消耗ミルビットに残りのサンプルを表現するために前方にプランジャーを押してください。組織片は現在、マイクロチューブの中に含まれます。
8。プロテイナーゼK消化を溶解サンプルは、熱処理が続く
- 組織サンプルを回復するためにプロテイナーゼK5μgのを含む70μlのTE pHが8.5を追加します。
- プログラム可能なヒーター·シェーカーにサンプルを置き、。
- 以下の設定でプログラム可能なヒーター、振とう機を用いて完全消化：1,500 rpmで30分間60˚C; 1,500 rpmで15分間、82˚C; 450 rpmで1分間25˚C。サンプルは現在、ダウンストリームアプリケーションのための準備ができています。
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Representative Results
上記のプロトコルは、FFPE組織スライドからRNAを抽出するために、新しいmesodissection技術を使用する方法を示しています。このプロトコルの有効性は、様々な感染段階でマウンテンバイクに感染NHPからの肺肉芽腫のFFPEスライドを通して示されている。1〜3は 、機器のイメージである図 。 図4は、解剖のプロセスがどのように発生するか示しているし、ソフトウェアで生成された結果のイメージ。 表1各感染状態でのNHPから肉芽腫とのRNA抽出の結果を示す。 RNAを、顕微解剖試料において、Mtbの増幅された、精製された16秒のRT-PCR証拠（ 表2-4）を可能にするために、表4は、Mtb のリボソームサブユニットの16Sの存在を確認した。
ジョイスティックを含むmesodissection器の図1の画像は 、この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図2 mesodissection器具のクローサー図。「z軸」ボタン、「モータ」の速度と、「吸引」速度ノブは画像の左側に示されている。 「吸引リセットボタン」および「オン/オフ」ボタンが画像の右側に示されている。スライドステージは、機器の上にある。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図3。ジョイスティックの拡大図。ジョイスティック、「吸引パルス」と示されている「ステージ速度」ボタンがあります。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図4。NHPのEB23からmesodissected全体肉芽腫の報告。本研究で用いた動物は、エアロゾルを介しCDC1551 MTbの感染させた。左の参照画像は、積極的に感染したアカゲザルからのH＆E染色肉芽腫を示しています。解剖されるべき所望の関心領域は緑に概説されている。真ん中翔画像解剖前の5ミクロンの厚さの対応する未染色のFFPEスライドWS。領域は、ソフトウェアを使用して整列し、近隣の相関領域は緑色に概説されている。右の画像は、同じ未染色のFFPEスライドポスト解剖を示している。解剖しエリアは青色で表されます。 400ミリメートル2消耗旋削ビットは、大きな解剖領域への媒体の横切開のために設計されて切開のために使用した。大きな切開領域は100mm未満2として記載されている。他のエリア/解剖タイプのために設計されサイズが用意されています。報告書は、0ミリメートル2として注釈面積を記載しているが、これは正確ではありません。我々はマシンから顕微解剖したスライドを削除して、物理的に関心自体の面積を見ると、私たちはもはや組織を有しているために解剖されたスライドに対応する領域を見ることができます。これは、著者が、機器をレンタルしていることに留意すべきであると、この問題は、他のinstrume上に固定されていますNTS。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
| 霊長類 | 感染性の状態 | NG /μL中のRNA濃度 | NG中の全RNA | 280分の260 | 230分の260 |
| EB23 | アクティブ | 48.3 | 724.5 | 1.71 | 1.59 |
| HB12 | 潜在的な | 61.4 | 921 | 1.7 | 1.86 |
| HP41 | SIVとの同時感染を経由して再活性化 | 22.3 | 334.5 | 1.9 | 2.18 |
表1。RNA濃度は、抽出を投稿してください。サンプルをDNAsedし、RNA抽出は、Qiagen社のRNAeasy FFPEキットを用いて行った。のRNA CONセンタリングは、ナノドロップを使用して得られた。 NHPの感染段階も示されている。 RNAは15μlのRNaseを含まない水で溶出した。
| 霊長類 | 感染性の状態 | NG /μL中のcDNA濃度 | NG中の全cDNA | 280分の260 | 230分の260 |
| EB23 | アクティブ | 31.7 | 951 | 2.08 | 2.37 |
| HB12 | 潜在的な | 156.5 | 4695 | 1.94 | 4.4 |
| HP41 | SIVとの同時感染を経由して再活性化 | 41.7 | 1251 | 2.19 | 3.44 |
表2。cDNAの濃度は、増幅および精製を投稿してください。NHPの感染の段階にも描かれている。 RNAは、オベーションのRNA - seqのFFPEシステム（部nを用いて増幅したO。 7150）および増幅されたcDNAを生じたことは増幅システムのユーザーガイドの26ページNugenが示唆するように、QIAGENのQIAquick PCR精製キットを用いて精製した。 cDNAを、30μlのTE緩衝液に溶出させた。
| よく | レポーター | CT | Tm値 |
| 16S 10月1日 | 標準 | 12.35138 | 79.4 |
| 16S 10月2日 | 標準 | 16.144611 | 79.4 |
| 16S 10月3日 | 標準 | 17.911345 | 79.4 |
| 16S 10月4日 | 標準 | 21.762596 | 79.4 |
| 16S 10月5日 | 標準 | 25.746624 | 79.4 |
| 16S 10月6日 | 標準 | 28.505266 | 79.1 |
| HB12 | 不明 25.771492 | 77.8 | |
| HP41 | 不明 | 17.760149 | 78 |
| EB23 | 不明 | 24.754618 | 78.2 |
| 負の制御 | NTC | 33.544422 | 79.7 |
表3 RT-PCRは、16Sリボソームサブユニットに関連して生じる。適切な増幅が試料内のMtbの存在を証明し、従って観察した。 Mtbの CDC1551菌株由来のゲノムDNAを、標準として使用した。
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Discussion
Mesodissectionは、病原体の広大な配列に起因する病理学的病変スライドからRNA抽出にも適用することができる技術である。これは、ユーザが画像を追跡し、画像を正しく整列させる必要があることである。これを達成するために、測定器はイメージングソフトウェアの指示に従って校正する必要があります。解剖すると解剖されている関心のスライドと面積が整列していない場合、ユーザは、機器を再調整しなければなりません。解剖プロセスの別の重要なステップは、それが前に解剖（ステップ5.1）に気泡を欠いているように消耗品旋削ビットをロードすることです。我々は、気泡の存在は、切開の収率が低下することを見出した。この問題を解決するために、我々は何回も推進し、プランジャーを表現するお勧めします。ユーザーは、メーカーが推奨するように、泡を視覚化するために練習バッファに食品着色料を追加することで、これを練習することができます。実効れると、ユーザーは、通常の解剖を進める必要があります。ラSTの重要なステップは、反時計方向にサンプルを分析することです。反時計方向に機械工場;従って、我々は、反時計回りに円を描くようにジョイスティックを動かすと、よりきれい後縁6よりも先端カットなどの組織の収率を増加させることを見出した。組織の収率を改善するための別の方法は、切開プロセスの速度を減少させることである。我々は、同時に「低」最高組織収量を生成するためにステージ速度の設定中に最低速度に吸引速度とモータ速度を設定することを見出した。このマイクロダイセクション法には2つの主な制限があります。最初の制限は、我々は原因解剖過程で反時計回りの円でジョイスティックを駆動する必要があるため、非常に困難な点郭清を発見したということです。第二の制限は、機器上のカメラは、高度な顕微鏡から生成される画像の細胞を詳細に欠ける画像を生成することである。
マウンテンバイクのトランスクリプトーム解析に関する直接の意味を持っています。肉芽腫形成は結核感染と肺5の限られた領域内で病原体が含まれているホストの試みの結果の特徴です。逆に、 マウンテンバイクが肉芽腫性病変7でのその持続性を可能にするように進化していることが提案されている。 のMtbの感染の段階に応じて異なる応力を受ける。これらの応力の一部が含まれるが、等7-13レドックスストレス、低pH、膜の損傷、低酸素、栄養不足、これらに限定されない。これらの様々な段階を通して、 マウンテンバイクは、まだ潜在型で生き残る、さらには再活性化することができます。これは、異なる遺伝子が異なる感染の段階でアップレギュレートおよびダウンレギュレートされることを意味します。例えば、 マウンテンバイクは、200以上の転写因子4をコードする。また、成功、異なるケモカインの間の発現のバランスが示されている肉芽腫内にα、βケモカインであるHは、重要な保護マーカーである8。肉芽腫性組織中のマイコバクテリアトランスクリプトミクスの評価は、感染の各状態で表現され、その形成と維持に関与するメカニズムだけでなく、それらの遺伝子の我々の理解を促進する可能性がある。これは、私たちは、積極的な潜伏と再活性化疾患だけでなく、肉芽腫自体の中の様々な領域を含む様々な結核感染の段階でマイコバクテリアトランスクリプトを評価することができるようになります。私たちは、別のマイコバクテリアトランスクリプトを評価することを可能にすることに加えて、上記の手順は、同じ感染状態の宿主トランスクリプトミクスの評価を可能にする。さらに、このアプローチは、次いで、比較対照すると、ホストと細菌との間の関係を分析するために使用することができる。
TBの研究において重要なツールであるが、上記のプロトコルは、他の病原体にも適用することができる。上記プロトコルは、感染した肺サンプルからのFFPEスライドを使用するだけでなく、他の器官からの病変に適用することができる。我々は、RNAを抽出するためにシステムを使用する方法を示すが、それは理論的に同等に有効と時間に敏感な方法でDNAとタンパク質抽出のために使用することができる。 FFPEブロックは、ほとんどの実験室の組織学部門で利用できます。従って、ここに記載の技術が飛躍的に、これらの現在使用されていない試料から得られた知識を増大させる可能性がある。
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Disclosures
著者らは、競合する経済的利益がないことを開示している。
Acknowledgments
R01HL106790、R01HL106790-S1、R01HL106786、R01AI089323、R21AI091457、R21RR026006、P20RR020159、C06RR017563、8T32OD011124-08、およびP51OD011104：著者らは、この研究のサポートについては、次のNIH賞/ subawardsを承認したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MeSectr | AvanSci Bio | Mesodissector | |
| 400 nm xScisors | AvanSci Bio | Other sizes available | |
| THOR | AvanSci Bio | Programmable Heater-Shaker | |
| NanoDrop2000 | ThermoScientific | ND-2000 | |
| RNeasy FFPE extraction kit | Qiagen | 73504 | |
| Ovation RNA-Seq FFPE System | Nugen | 7150 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 |
References
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Tags
免疫学、発行88、顕微解剖、mesodissection、ホルマリン固定パラフィン包埋、Erratum
Formal Correction: Erratum: A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas
Posted by JoVE Editors on 07/01/2014.
Citeable Link.
The corresponding author was changed for the article, A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas. The corresponding author was changed from:
Teresa A. Hudock
to:
Deepak Kaushal
