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Summary
显微切割已被广泛地用于DNA，RNA，和在组织内蛋白质的检查。激光捕获显微术（LCM）是最常用的方法，而是一种新的研磨技术，mesodissection，是最近可用。我们证明RNA提取从mesodissected福尔马林固定，石蜡的结核分枝杆菌肉芽肿包埋组织幻灯片。
Abstract
显微切割已被用于组织的检查在DNA，RNA和蛋白水平超过十年。激光捕获显微术（LCM）是当今使用的最常见的显微切割技术。在该技术中，激光被用来灶性熔融的热塑性膜，其覆盖一个脱水的组织切片1。组织切片复合，然后抬起并从该膜分离。尽管这种技术可以成功地用于组织检查，这是耗时且昂贵的。此外，在成功完成使用这种技术的程序需要使用的激光的，从而限制了它的使用。所谓mesodissection一个新的更加实惠和实用显微切割方法是一种可行的解决方案，以LCM的陷阱。该技术采用了MESO-1/MeSectr系统轧机从幻灯片上的组织试样所需的组织，而同时分配和吸液至所需的组织样品恢复到耗材厂位。在解剖过程开始时，用户对齐福尔马林固定，石蜡包埋（FFPE）用苏木精伊红染色（H＆E）的参考滑盖滑动。此后，操作者诠释所需的解剖区域，并且前进到解剖相应的段。该程序生成的解剖的存档影像。 mesodissection的主要优点是解剖的滑动所需要的时间短，取平均10分钟从设置采样在该实验中产生。此外，该系统是显著更加成本有效的和用户友好。轻微缺点是，它并不像精确的激光捕获显微术。在这篇文章中我们将演示如何mesodissection可以使用从引起结核分枝杆菌（结核杆菌）FFPE肉芽肿幻灯片中提取的RNA。
Introduction
样品在传统上被手动从任一整个组织或使用针和解剖刀载玻片进行显微解剖。这就需要感兴趣的组织切片与周围组织部分2之间的明确分工。随着分子分析技术目前的进展，出现了越来越需要在细胞水平来评估组织。由于手工显微切割的局限性，已建立的技术包括液晶显示模块，以允许更大的隔离精度。这种技术允许研究者隔离从各种细胞和滑动类型的特定细胞群，然后其可用于下游分析，如基因表达分析。虽然非常有效的下游检测，液晶显示模块也不是没有限制的。首先，LCM是一个昂贵和费时的过程。此外，由于RNA的性质不稳定，它往往是具有挑战性的从LCM样品2获得高质量的RNA。由于diLCM的sadvantages，仍然需要在显微切割技术的新进展，使之更容易在一个合理的时间和敏感的方式更大一些研究人员。
在显微切割技术现在可一个这样的进步是被称为mesodissection的技术。在这种技术中一台机器是用来磨感兴趣的注解组织切片，并吸取它变成一种消耗品磨位3。下一步，该样品被吸入到一个集合管和用于下游应用。这个系统的优点是，它是显著成本较低和时间敏感。在我们的经验中，系统允许在十分钟内肺肉芽肿组织部分的剥离。在另一方面，传统的LCM将可能需要数小时才能完成该过程。该系统允许操作者装入一个参考幻灯片作为比较以及工具注解来使用。另外一个报告生成概述日E区被解剖的幻灯片。有两个主要的缺点mesodissection。虽然在提取多个单元格有效，它是具有挑战性的分离单个细胞。此外，所产生的图像的精度不明确的，因为如果使用其他成像显微镜。
结核病（TB）是人类的一个全球主要的传染病杀手，从感染的结果与结核杆菌 。在大多数暴露于结核分枝杆菌的气溶胶个体，这种感染潜伏的限制。在每年至少 有10万人，它导致活动性肺结核病4。在潜伏感染， 结核杆菌包含称为肉芽肿病理性肺部病灶内。因此，它已被认为结核杆菌感染的结果决定于肉芽肿5的水平。
在这里，我们展示mesodissection如何可以用来microdissect引起结核杆菌肉芽肿。所使用的幻灯片是从被感染的恒河猴FFPE肺组织。此演示的目的，我们将剖析肉芽肿的全部。我们还证明，RNA可从回收的组织被提取。这种技术可以应用于组织样品从各种其他标本，然后用于各种下游检测的。
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Protocol
1，校准Mesodissection仪器与2ID成像软件
该2ID成像软件将被称为无论是软件或程序为本文的其余部分。这一步是需要正确地跟踪图像以及对齐多个幻灯片框架。
- 打开仪器和计算机。
- 打开软件，选择“校准仪器”。
- 通过使用操纵杆校准阶段行程。移动舞台左上角的位置。按“设置”下的程序步骤1。
- 现阶段移动到右下角的位置。按“设置”下的程序步骤2。
- 首先按“Z键”，以提高磁头组件校准愿望。按“吸脉冲”按钮和“解剖”按钮操纵杆，直到柱塞控制杆到达顶部位置。按“设置”下的程序的步骤3。
- 按下“抽吸复位＆＃8221;按钮。一旦活塞停止在步骤4中的底部位置按“SET”。
- 点击“刻度标签”上。
- 将校准标尺上的空白一面。
- 如果需要集中显微镜。
- 绘制鼠标使用两比例尺之间的线。
- 在标第2步，按“计算”按钮，进入距离。
- 点击“十字准线”选项卡。转电机转速为1。
- 将xScisor成头组件。下磁头组装成z轴的准备位置，按“z轴”按钮。注：头组件在顶部的解剖仪器的大型结构。该xScisor将被称为耗材厂位在本文的其余部分。
- 点击“解剖搞”按钮操纵杆。注：此按钮位于操纵杆顶部。
- 定义旋转中心视觉。要做到这一点，使用定义移动十字线的中心在旋转中心在程序的步骤1 d参数。使用向上和向下箭头在“x”和“y轴”条来调整像素对齐的十字线。点击“完成”选项卡。
- 点击“主页”标志。注意：这是由位于右上角的房子形象代表。
2，创建参考图像
- 将H＆E幻灯片上舞台。将不透明的盖子顶部的滑动。通过移动操纵杆H＆E幻灯片的所需区域带动仪器。保存生成的图像。注意：无论是“捕获引用”选项卡或“解剖”选项卡可以用来完成此步骤。
3，对准组织的解剖
- 点击主屏幕上的“解剖组织”选项。
- 填写“经营者”，“解剖登录号”，“参考入藏号”，“xScisor条码号，”＆＃8220;剥离液批号“，”xScisor大小“，然后在”设置“选项卡中”说明“。
- 点击“查找组织”选项卡上。
- 导入之前保存的参考图像。
- 放置在舞台上的5微米厚的未染色FFPE幻灯片。移动台以相同的区域在参考图像中所描绘的。点击“插入图片”选项卡。
- 单击“对齐”选项卡。使用鼠标和相关的箭头来参考图像调整到未染色的图像。
4。幻灯片注释
- 点击“注释”选项卡上。
- 使用鼠标绘制一个围绕将显微切割的幻灯片所需区域的圆。
5，载入耗材穆勒位
- 填耗材轧机位具有所需缓冲液，此处PKD缓冲液中，通过拉动柱塞上下中的流体运动数次。请务必排除空气气泡。
- 按“Z轴键”提高Z轴。
- 加载耗磨位成机器。通过滑动耗材厂位到机器的顶部做到这一点，这样的白线在仪器上线与黑线耗材厂位。按“吸RESET”键，以便柱塞下降到正确的位置。注：这应该很容易滑动耗材厂位。如果不是，请确定缺口是否正确对齐。
- 低Z轴再次按下“Z轴”按钮。
6，解剖组织（ 图4）
- 打开“解剖”选项卡。
- 转电机和愿望速度为1。
- 勾选“显示跟踪”复选框。注意：此允许用户在解剖过程中可视化的解剖区域。
- 一旦准备解剖，继续举办“搞”按钮以及“抽吸＆＃8221;按钮的同时移动操纵杆以逆时针方向解剖组织。
- 继续在反时针方向进行解剖，直到吸液是“满”标签变成红色。
7，清空和删除耗材穆勒位
- 放置一个0.5微升离心管耗材磨钻头的尖下。
- 按“吸金”控制棒迅速弹出样品放入离心管中。
- 新闻与增加力量弹出使用过的耗材厂位。
- 通过拉动活塞回冲洗组织片段。推动活塞前进，以表达剩下的样品放入粉碎机易损位。所述组织片段现在将包含在微量离心管内。
8，裂解样品用蛋白酶K消化热处理
- 加入含5微克蛋白酶K至恢复组织样品70微升的TE pH值8.5。
- 将样品放入可编程加热器振动筛。
- 采用可编程加热器摇床在以下设定完全消化：60˚C，30分钟在1500转; 82˚C下15分钟在1500转; 25˚C为450转1分钟。样品现在即可下游应用。
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Representative Results
上述协议显示了如何使用新的mesodissection技术从FFPE组织切片中提取的RNA。该协议的有效性是通过从NHP肺肉芽肿在各类感染阶段感染了结核杆菌的FFPE幻灯片所示。 图1-3是仪器。 图4的图像描绘了如何在解剖过程中发生，并通过该软件。 表1中生成的结果图像示出的RNA提取与来自NHP肉芽肿在每个感染状态的结果。 RNA扩增和纯化，以允许16秒（ 表2-4）的RT-PCR证据。 表4证实了结核杆菌核糖体亚基16S的存在，并且因此结核杆菌的显微样品中。
图中mesodissection仪器包括操纵杆1。图片。 请点击这里查看这个数字的放大版本。
图2。的mesodissection仪器近观的 “Z轴”按钮，“马达”速度与“吸金”的速度旋钮，显示在图像的左侧。的“吸气器复位按钮”和“开/关”按钮被显示在右侧的图像。幻灯片阶段是在仪器的顶部。 请点击这里查看这个数字的放大版本。
图3。摇杆的近观。操纵杆，“抽吸脉冲”，并表示“段速”按钮。 请点击此处查看该图的放大版本。
整个肉芽肿从NHP EB23 mesodissected的图4。报告。在本研究中使用的动物通过气溶胶感染了结核杆菌 CDC1551。在左边的参考图像示出了H＆E染色肉芽肿从积极感染恒河猴。的被解剖的兴趣所需的区域以绿色概述。在中间笑图像WS的解剖前5微米的厚度相应的未染色FFPE幻灯片。使用该软件的区域被对齐和感兴趣区域相关联的绿色概述。右侧的图像描绘了同样的未染色FFPE幻灯片后淋巴结清扫术。解剖区域被表示为蓝色。 400毫米2耗材厂位被用于解剖，这是专为介质的横向清扫大面积剥离。大解剖区域被描述为小于100毫米2。专为其他地区/解剖类型尺寸可供选择。虽然该报告描述了注解面积为0时平方毫米，这是不准确的。当我们应从机器上取下的显微载玻片和身体看看自身利益的领域，我们可以看到对不再具有组织也因此被解剖幻灯片中的相应区域。应该指出的是，作者是租用仪器，这问题已得到修复在其他instrumeNTS。 请点击这里查看这个数字的放大版本。
| 灵长类动物 | 感染国家 | 以ng /μLRNA浓度 | 总RNA纳克 | 260/280 | 二百三十〇分之二百六十零 |
| EB23 | 活跃 | 48.3 | 724.5 | 1.71 | 1.59 |
| HB12 | 潜 | 61.4 | 921 | 1.7 | 1.86 |
| HP41 | 通过共同感染了SIV激活 | 22.3 | 334.5 | 1.9 | 2.18 |
表1 RNA浓度后提取 。该样本是DNAsed和使用Qiagen RNAeasy FFPE试剂盒进行RNA提取。 RNA的浓度使用NanoDrop得到中心定位。 NHP感染阶段也被描绘。 RNA的洗脱在15μL无RNA酶的水。
| 灵长类动物 | 感染国家 | 以ng /μL的cDNA浓度 | 总的cDNA为ng | 260/280 | 二百三十〇分之二百六十零 |
| EB23 | 活跃 | 31.7 | 951 | 2.08 | 2.37 |
| HB12 | 潜 | 156.5 | 4695 | 1.94 | 4.4 |
| HP41 | 通过共同感染了SIV激活 | 41.7 | 1251 | 2.19 | 3.44 |
表2。cDNA的浓度后扩增和纯化。NHP感染阶段还描绘。使用的Ovation RNA的序号FFPE系统（部件n的RNA扩增Ø。 7150），并使用QIAGEN公司的QIAquick PCR纯化试剂盒的放大系统的用户手册第26页上的建议的NuGEN的产生扩增的cDNA进行纯化。的cDNA被洗脱在30μl的TE缓冲液中。
| 好 | 记者 | 克拉 | Tm值 |
| 16S 10-1 | 标准 | 12.35138 | 79.4 |
| 16S 10-2 | 标准 | 16.144611 | 79.4 |
| 16S 10-3 | 标准 | 17.911345 | 79.4 |
| 16S 10-4 | 标准 | 21.762596 | 79.4 |
| 16S 10-5 | 标准 | 25.746624 | 79.4 |
| 16S 10-6 | 标准 | 28.505266 | 79.1 |
| HB12 | 未知 25.771492 | 77.8 | |
| HP41 | 未知 | 17.760149 | 78 |
| EB23 | 未知 | 24.754618 | 78.2 |
| 阴性对照 | NTC | 33.544422 | 79.7 |
表3 RT-PCR结果相对于16S核糖体亚基。观察由此证明结核分枝杆菌的样品中存在的适当的放大。从CDC1551菌株结核分枝杆菌的基因组DNA作为标准。
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Discussion
Mesodissection是可以从所引起的病原体繁多病理病变的幻灯片被应用于RNA提取的技术。它是用户跟踪图像和正确对齐的图像是必要的。要做到这一点，该仪器必须跟随在成像软件的方向进行校正。解剖时，如果被解剖的兴趣幻灯片和面积不对齐，用户必须重新校准仪器。在剥离过程中的另一个重要步骤是加载自耗磨位的方式之前，夹层（步骤5.1），使得它是不含气泡。我们已经发现，气泡的存在降低了夹层的产量。要更正此问题，我们建议推动和表达柱塞多次。用户可以通过添加食用色素为实践缓冲器以可视化的气泡，如制造商建议的实施本。一旦有效，用户应再继续正常解剖。洛杉矶ST关键步骤是解剖样品中的反时针方向。机器造纸厂在反时针方向;因此，我们发现，移动操纵杆以圆周运动以逆时针方式增加产量的组织作为前缘切比后缘6更干净。另一种方式来改善组织产量是降低夹层过程的速度。我们发现，设置吸率和电机转速的最低速度，同时设置阶段速度设定为“低”的生产组织最高产量。有这种显微切割方法有两个主要限制。第一个限制是，我们已经找到一点非常清扫由于需要驾驶操纵杆逆时针圆在解剖过程中充满挑战。第二个限制是，在仪器上的相机生成缺少从一个高级显微镜产生的图像的细胞细节的图像。
结核杆菌的转录组分析的直接影响。肉芽肿形成是结核感染，并从主机的企图遏制肺癌5的密闭区域内的病原体结果的一个标志。相反，已经提出的Mtb已经发展到允许其在肉芽肿性病变7的持久性。 结核杆菌经受不同的应力取决于感染的阶段。一些这些应力包括但不限于氧化还原应力，低pH，膜损伤，缺氧，营养缺乏，等等7-13。纵观这些不同阶段， 结核杆菌可以处于潜伏的形式仍然屹立不倒，甚至重新激活。这意味着，不同的基因表达上调和下调的不同感染阶段。例如， 结核杆菌编码超过200转录因子4。另外，它已经表明，不同的趋化因子间的平衡表达，SUCH为α和β趋化因子，肉芽肿内可能是重要的保护指标8。评价肉芽肿组织分支杆菌转录很可能促进我们的表达在感染每个国家参与其形成机制和维护，以及这些基因的认识。这将使我们能够评估分枝杆菌转录各种结核病感染阶段，包括积极的，潜在的，重新疾病以及肉芽肿本身内各个区域。除了允许我们进一步评估分枝杆菌转录，上述程序还允许宿主转录在同一感染状态的评估。此外，这种方法则可以用来比较，对比和分析主机和细菌之间的关系。
虽然在结核病研究中的重要工具，上述协议可以被应用到其它的病原体为好。以上协议使用FFPE载玻片从受感染的肺样品，但也可以应用到病变从其他器官。我们将演示如何使用系统来提取RNA，但理论上可以在一个同样有效和时间敏感的方式用于DNA和蛋白质的提取。 FFPE块可在大多数实验室组织学部门;因此，这里所描述的技术具有成倍增加从这些当前未使用的样本中获得的知识的可能性。
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Disclosures
作者透露，目前并无任何竞争经济利益。
Acknowledgments
作者要感谢以下美国国立卫生研究院奖项/ subawards对本研究的支持：R01HL106790，R01HL106790-S1，R01HL106786，R01AI089323，R21AI091457，R21RR026006，P20RR020159，C06RR017563，8T32OD011124-08，和P51OD011104。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MeSectr | AvanSci Bio | Mesodissector | |
| 400 nm xScisors | AvanSci Bio | Other sizes available | |
| THOR | AvanSci Bio | Programmable Heater-Shaker | |
| NanoDrop2000 | ThermoScientific | ND-2000 | |
| RNeasy FFPE extraction kit | Qiagen | 73504 | |
| Ovation RNA-Seq FFPE System | Nugen | 7150 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 |
References
- Fend, F., Raffeld, M.
- Esposito, G. Complementary techniques: laser capture microdissection--increasing specificity of gene expression profiling of cancer specimens. Adv Exp Med Biol. 593, 54-65 (2007).
- Adey, N., Bosh, D., Emery, D., Birch, L., Parry, R. Mesodissection of Paraffin Embedded Slide Mounted Tissue Sections. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (6), (2012).
- Fleischmann, R. D., Alland, D., Eisen, J. A., Carpenter, L., White, O., Peterson, J., et al. Whole-genome comparison of Mycobacterium tuberculosis clinical and laboratory strains. J Bacteriol. 184 (19), 5479-5490 (2002).
- Russell, D. G., Barry 3rd, C. E., Flynn, J. L. Tuberculosis: what we don't know can, and does, hurt us. Science. 328 (5980), 852-856 (2010).
- Paige, C., Bishai, W. R. Penitentiary or penthouse condo: the tuberculous granuloma from the microbe's point of view. Cell Microbiol. 12 (3), 301-309 (2010).
- Mehra, S., Alvarez, X., Didier, P. J., Doyle, L. A., Blanchard, J. L., Lackner, A. A., et al. Granuloma correlates of protection against tuberculosis and mechanisms of immune modulation by Mycobacterium tuberculosis. J Infect Dis. 207 (7), 1115-1127 (2013).
- Kaushal, D., Schroeder, B. G., Tyagi, S., Yoshimatsu, T., Scott, C., Ko, C., et al. Reduced immunopathology and mortality despite tissue persistence in a Mycobacterium tuberculosis mutant lacking alternative sigma factor, SigH. Proc Natl Acad Sci U S A. (12), 8330-8335 (2002).
- Mehra, S., Kaushal, D. Functional genomics reveals extended roles of the Mycobacterium tuberculosis stress response factor sigmaH. J Bacteriol. 191 (12), 3965-3980 (2009).
- Rohde, K. H., Veiga, D. F., Caldwell, S., Balazsi, G., Russell, D. G. Linking the transcriptional profiles and the physiological states of Mycobacterium tuberculosis during an extended intracellular infection. PLoS Pathog. 8 (6), (2012).
- Fontan, P. A., Voskuil, M. I., Gomez, M., Tan, D., Pardini, M., Manganelli, R., et al. The Mycobacterium tuberculosis sigma factor sigmaB is required for full response to cell envelope stress and hypoxia in vitro, but it is dispensable for in vivo growth. J Bacteriol. 191 (18), 5628-5633 (2009).
- Rustad, T. R., Harrell, M. I., Liao, R., Sherman, D. R. The enduring hypoxic response of Mycobacterium tuberculosis. PLoS One. 3 (1), (2008).
Tags
免疫学，第88期，显微切割，mesodissection，福尔马林固定，石蜡包埋，Erratum
Formal Correction: Erratum: A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas
Posted by JoVE Editors on 07/01/2014.
Citeable Link.
The corresponding author was changed for the article, A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas. The corresponding author was changed from:
Teresa A. Hudock
to:
Deepak Kaushal
