ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Microdissection har i stor utsträckning använts för undersökning av DNA, RNA och protein i vävnader. Laser capture mikroskopi (LCM) är den vanligaste metoden, men en ny frästeknik, mesodissection är senast tillgängliga. Vi visar RNA-extraktion från mesodissected formalinfixerade paraffininbäddade vävnads diabilder av Mycobacterium granulom tuberkulos.
Abstract
Microdissection har använts för undersökning av vävnader på DNA, RNA och proteinnivåer i över ett decennium. Laser capture mikroskopi (LCM) är den vanligaste microdissection teknik som används idag. I denna teknik, är en laser används för att focally smälta en termoplast membran som ligger över en uttorkad vävnad avsnitt 1. Den vävnadssektion sammansatt lyfts sedan och separeras från membranet. Även om denna teknik kan användas med framgång för vävnads undersökning, är det tidskrävande och dyrt. Dessutom, det framgångsrika slutförandet av förfaranden som använder denna teknik kräver användning av en laser, vilket begränsar dess användning. En ny mer prisvärd och praktisk microdissection metod som kallas mesodissection är en möjlig lösning på de fallgropar av LCM. Denna teknik utnyttjar MESO-1/MeSectr systemet till kvarn önskad vävnad från en bild monterad vävnadsprov medan samtidigt dispensering och aspirera vätska för att återvinna den önskade vävnadsprovet ien förbruknings kvarn bit. Före dissektion processen börjar, justerar användaren formalin fasta paraffininbäddade (FFPE) glida med ett hematoxylin och eosin färgade (H & E) referens slide. Därefter annotates operatören det önskade dissektion område och fortsätter att dissekera det lämpliga segmentet. Programmet genererar en arkiverad bild av dissekering. Den huvudsakliga fördelen med mesodissection är den korta varaktigheten som behövs för att dissekera en slid, med ett genomsnitt av tio minuter från inrättat att sampla generationen i detta experiment. Dessutom är systemet avsevärt mer kostnadseffektiv och användarvänlig. En liten nackdel är att det inte är så noggrann som laser capture mikroskopi. I den här artikeln visar vi hur mesodissection kan användas för att extrahera RNA från diabilder från FFPE granulom orsakas av Mycobacterium tuberculosis (Mtb).
Introduction
Prover har traditionellt manuellt microdissected antingen hel vävnad eller bilder med hjälp av en nål och skalpell. Detta kräver en tydlig åtskillnad mellan vävnadssektionen av intresse och omgivande vävnader avsnitt 2. Med nuvarande framsteg inom molekylär profilering teknik, har det funnits ett ökande behov av att bedöma vävnad på cellnivå. På grund av de begränsningar av manuell microdissection, var tekniker inklusive LCM inrättats för att möjliggöra ökad isolering precision. Denna teknik gör det möjligt för forskare att isolera specifika cellpopulationer från olika cell-och objektglastyper, som sedan kan användas för efterföljande analyser såsom genuttryck profilering. Även mycket effektiv för efterföljande analyser, är LCM inte utan begränsningar. För det första är LCM en dyr och tidskrävande process. Dessutom, på grund av den instabila naturen hos RNA, är det ofta en utmaning att erhålla högkvalitativt RNA från LCM-proverna 2. På grund av den disadvantages av LCM, behövs fortfarande nya framsteg inom microdissection teknik för att göra det mer tillgängligt för ett större antal forskare i ett prisvärt och tidskänsliga sätt.
En sådan utveckling i microdissection teknik nu är en teknik som kallas mesodissection. I denna teknik en maskin används för att fräsa den kommenterade vävnadssnitt av intresse och suger den till en förbruknings kvarn bit 3. Därefter kan detta prov sugas in i ett provrör och används för tillämpningar efter. Fördelarna med detta system är att det är betydligt mindre kostsamt och tidskänsliga. Enligt vår erfarenhet, tillåter systemet dissektion av en lunga granulom vävnadssektion i tio minuter. Å andra sidan, skulle traditionell LCM sannolikt kräva timmar att slutföra processen. Systemet gör det möjligt för operatören att ladda en referens bildspel att använda som en jämförelse samt verktyg för anteckning. Dessutom en rapport genereras beskriver the område av bilden som dissekerades. Det finns två huvudsakliga nackdelar att mesodissection. Även effektiv vid extraktion av flera celler, är det svårt att isolera en enda cell. Dessutom är precisionen i bilden genereras inte lika tydligt som om du använder andra bild mikroskop.
Tuberkulos (tbc) är en viktig infektionssjukdom mördare av mänskligheten i världen och resultatet av infektion med Mtb. I en majoritet av individer som utsätts för aerosoler av Mtb, är infektionen latent begränsad. I åtminstone 10 miljoner människor per år, resulterar det i aktiv tuberkulos 4. Under latent infektion är Mtb finns inom patologiska lunglesioner kallas granulom. Därför har det hävdats att resultatet av Mtb infektion bestäms på samma nivå som den granulom 5.
Här visar vi hur mesodissection kan användas för att microdissect granulom orsakade av Mtb. Bilderna som användsär från FFPE lungvävnad från infekterade rhesusapamacaques. För denna demonstration kommer vi dissekera granulom i sin helhet. Vi visar också att RNA kan extraheras från den återvunna vävnaden. Denna teknik kan tillämpas på vävnadsprover från olika andra prover och sedan användas för en variation av efterföljande analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kalibrera Mesodissection Instrument med 2id Imaging Software
Den 2id bildbehandlingsprogram kommer att benämnas antingen programmet eller programmet för resten av den här artikeln. Behövs för detta steg för att korrekt spåra bilden samt justera flera bildramar.
- Slå på instrumentet och datorn.
- Öppna program och välj "kalibreringsinstrument".
- Kalibrera skede resor med hjälp av joysticken. Flytta scenen till övre vänstra positionen. Tryck på "set" i steg 1 i programmet.
- Flytta scenen till lägre rätt position. Tryck på "set" i steg 2 i programmet.
- Kalibrera aspiration genom att först trycka på "Z-knappen" för att höja huvudenheten. Tryck på "aspirera puls" och "dissektion"-knappen på styrspaken tills kolvstyrstången når toppositionen. Tryck på "set" i steg 3 i programmet.
- Tryck på "aspirera återställning &# 8221; knappen. När kolven stannar i botten läget tryck på "set" i steg 4.
- Klicka på "skalan fliken".
- Placera kalibrerings linjal på tomma sidan.
- Fokus mikroskop vid behov.
- Rita linje mellan de två skal linjerna med musen.
- Ange avståndet i rutan steg 2 Tryck på "beräkna"-knappen..
- Klicka på "hårkors" fliken. Vrid motorns varvtal till 1.
- Sätt xScisor in huvudet. Nedre huvudaggregatet in i z-axeln klarläget genom att trycka på "z-axel"-knappen. OBS: Huvudaggregatet är den stora strukturen på toppen dissekering instrumentet. Den xScisor kommer att hänvisas till som en förbruknings kvarn lite för resten av den här artikeln.
- Klicka på "dissektion engagera"-knappen på joysticken. OBS: Den här knappen är placerad på toppen av joysticken.
- Definiera rotationscentrum visuellt. För att göra detta, flytta mitt i hårkorset över rotationscentrum med hjälp definierad parametern i steg 1 i programmet. Använd upp och ner pilarna i "x" och "y-axeln" barer att justera bildpunkter för att anpassa hårkors. Klicka på "Klar"-fliken.
- Klicka på "Hem"-ikonen. OBS: Detta representeras av ett hus bild som ligger i det övre högra hörnet.
2. Skapa Referensbild
- Placera H & E glida på scen. Placera ogenomskinligt lock ovanpå bilden. Kör instrumentet genom att föra styrspaken till önskat område av H & E slide. Spara bilden som genereras. OBS: Antingen "capture referens" flik eller "dissekera"-fliken kan användas för att slutföra det här steget.
3. Rikta Mjukpapper för Dissection
- Klicka på "dissekera vävnad" alternativet på huvudmenyn.
- Fyll i "operatör", "dissektion anslutningsnummer," "referensnummer anslutningen," "xScisor streckkodsnumret," & #8220, dissektion flytande partinummer, "" xScisor size "och" beskrivning "på" setup "-fliken.
- Klicka på "hitta vävnad" fliken.
- Importera tidigare sparat referensbild.
- Placera en ofärgade FFPE glida av 5 mikron tjocklek på scenen. Flytta stadiet till samma område som den som avbildas i referensbilden. Klicka på "Infoga bild"-fliken.
- Klicka på "align"-fliken. Använd musen och tillhörande pilarna för att anpassa referensbild till den ofärgade bilden.
4. Anno Slide
- Klicka på "Kommentera"-fliken.
- Använd musen för att rita en cirkel runt önskat område av bilden som ska microdissected.
5. Ladda förbruknings Mill Bit
- Fyll förbruknings kvarn bit med önskad buffert, här PKD buffert, genom att dra kolven upp och ner i en flytande rörelse flera gånger. Se till att utesluta luftbubblor.
- Höj Z-axeln genom att trycka på "Z-axelknappen".
- Fyll på förbruknings kvarn bit in i maskinen. Gör detta genom att skjuta förbruknings kvarnen bit in i toppen av maskinen så att den vita linjen på instrument ställer upp med det svarta strecket på förbruknings mill bit. Tryck på "aspiration reset" för att låta kolven att sänkas i rätt läge. OBS: Det ska vara lätt att skjuta förbruknings mill bit. Om det inte är det, se till att skårorna är korrekt inriktade.
- Lägre Z-axeln genom att åter trycka på "Z-axeln"-knappen.
6. Dissekera vävnad (Figur 4)
- Öppna "dissekera" fliken.
- Vrid motor-och aspirationshastigheter till 1.
- Kontrollera "visa tracking" rutan. Anmärkning: Detta tillåter användaren att visualisera den dissekerade område under dissektionen processen.
- En gång redo att dissekera, fortsätta att hålla "engagera"-knappen och "aspirera & #8221; knappen under förflyttning joysticken i en moturs riktning för att dissekera vävnad.
- Fortsätt att dissekera moturs tills aspirera är "fullt"-fliken blir röd.
7. Töm och ta bort förbruknings Mill Bit
- Placera en 0,5 l mikrofugrör under spetsen på förbruknings mill bit.
- Tryck på "aspiration" styrstång snabbt för att mata ut provet i mikrofugrör.
- Tryck med ökad kraft för att mata använda förbruknings kvarn bit.
- Skölj vävnad fragment genom att dra tillbaka kolven. Tryck kolven framåt för att uttrycka återstående prov i förbruknings kvarn bit. Vävnaden fragment kommer nu att innesluten i mikrofugrör.
8. Lyse Prov med proteinas K Digestion följt av en värmebehandling
- Lägg 70 pl TE pH 8,5 innehållande 5 mikrogram av proteinas K till återvunna vävnadsprov.
- Placera provet i programmerbara värmare-shaker.
- Fullständig nedbrytning med hjälp av programmerbara värmare-shaker vid följande inställning: 60 ˚ C i 30 minuter vid 1500 rpm; 82 ˚ C i 15 minuter vid 1500 rpm; och 25 ˚ C under 1 min vid 450 rpm. Provet är nu klar för tillämpningar efter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den tidigare nämnda protokoll visar hur man använder en ny mesodissection teknik för att extrahera RNA från FFPE vävnad diabilder. Detta protokoll effektivitet visas genom FFPE diabilder av lung granulom från NHP infekterade med Mtb i olika infektiösa stadier. Figurerna 1-3 är bilder av instrumentet. Figur 4 visar hur dissektion process sker och den resulterande bilden som genereras av programvaran. Tabell 1 visar resultaten av RNA-extraktion med ett granulom från en NHP vid varje infektiöst tillstånd. RNA amplifierades och renades för att möjliggöra för RT-PCR-bevis på 16s (tabellerna 2-4). Tabell 4 bekräftar närvaron av Mtb ribosomala subenheten 16S och sålunda Mtb, i microdissected prover.
Figur 1. Bild mesodissection instrument inklusive joystick. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Närmare bild av mesodissection instrumentet. "Z-axeln"-knappen, "motor" fart och "aspiration" speed knoppar visas på vänster sida av bilden. Den "sug reset-knappen" och "on / off" knappen visas på höger sida av bilden. Glid steget är på toppen av instrumentet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Närmare bild av joysticken. Joysticken, "aspirera puls" och "etapp speed"-knapparna som visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Rapport av hela granulom mesodissected från NHP EB23. Djur som används i denna studie infekterades med CDC1551 MTB via aerosol. Referens Bilden till vänster visar en H & E färgade granulom från en aktivt infekterade rhesus makak. Den önskade området av intresse som skall dissekeras skisseras i grönt. Bilden i mitten shows motsvarande ofärgade FFPE glida av 5 mikron tjocklek före dissekering. De områden som var i linje med hjälp av programmet och korrelera intresseområde beskrivs i grönt. Bilden till höger visar samma ofärgade FFPE slide inlägget dissektion. Området dissekerade representeras i blått. En 400 mm 2 förbruknings kvarn bit användes för dissektion, som är utformad för travers dissektion av medelstora till stora dissektion område. Stor dissektion området beskrivs som mindre än 100 mm 2. Storlekar avsedda för andra områden / dissektion typer finns tillgängliga. Trots att rapporten beskriver den kommenterade område som 0 mm 2, är denna felaktiga. När vi tar bort microdissected glida från maskinen och fysiskt titta på det intressanta området i sig, kan vi se motsvarande område i bilden som inte längre har vävnad och därför har dissekeras. Det bör noteras att författarna hyr instrumentet och denna fråga har rättats på andra instruments. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Primat | Infektiös State | RNA-koncentrationen i ng / ^ il | Total-RNA i ng | 260/280 | 260/230 |
| EB23 | Aktiv | 48,3 | 724,5 | 1,71 | 1,59 |
| HB12 | Latent | 61,4 | 921 | 1,7 | 1,86 |
| HP41 | Aktiveras genom samtidig infektion med SIV | 22,3 | 334,5 | 1,9 | 2,18 |
Tabell 1. RNA koncentrationer posta extraktion. Provet DNAsed och RNA-extraktion utfördes med användning av Qiagen RNAeasy FFPE kit. RNA-concentrationen erhölls med användning av en Nanodrop. NHP infektiösa stadier visas också. RNA eluerades i 15 ^ il RNas-fritt vatten.
| Primat | Infektiös State | cDNA-koncentrationen i ng / l | Totalt cDNA i ng | 260/280 | 260/230 |
| EB23 | Aktiv | 31,7 | 951 | 2,08 | 2,37 |
| HB12 | Latent | 156,5 | 4695 | 1,94 | 4,4 |
| HP41 | Aktiveras genom samtidig infektion med SIV | 41,7 | 1251 | 2,19 | 3,44 |
Tabell 2. CDNA koncentrationer posta amplifiering och rening. NHP infektiösa stadier visas också. RNA amplifierades med användning Ovation RNA-Seq FFPE System (del no. 7150) och resulterande förstärkta cDNA renades med hjälp av QIAGEN QIAquick PCR Purification Kit som föreslagits av NuGEN på sidan 26 i förstärkningssystemets bruksanvisning. cDNA: t eluerades i 30 | il TE-buffert.
| Väl | Reporter | Ct | Tm-värde |
| 16S 10-1 | Standard | 12,35138 | 79,4 |
| 16S 10-2 | Standard | 16.144611 | 79,4 |
| 16S 10-3 | Standard | 17.911345 | 79,4 |
| 16S 10-4 | Standard | 21.762596 | 79,4 |
| 16S 10-5 | Standard | 25.746624 | 79,4 |
| 16S 10-6 | Standard | 28.505266 | 79,1 |
| HB12 | Okänd 25.771492 | 77,8 | |
| HP41 | Okänd | 17.760149 | 78 |
| EB23 | Okänd | 24.754618 | 78,2 |
| Negativ kontroll | NTC | 33.544422 | 79,7 |
Tabell 3. RT-PCR-resultat med avseende på 16s subenheten. Lämplig förstärkning observeras som styrker förekomsten av Mtb inom prover. Genomiskt DNA från CDC1551 stam Mtb användes som en standard.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mesodissection är en teknik som kan tillämpas på RNA-extraktion från patologiska lesioner diabilder som orsakas av ett brett spektrum av patogener. Det är en nödvändighet att användaren spårar bilden och justerar bilden korrekt. För att åstadkomma detta måste instrumentet kalibreras efter anvisningarna på bildprogram. När dissekera, om bilden och intresseområde som dissekeras inte kan passas in, måste användaren kalibrera instrumentet. Ett annat kritiskt steg i dissekering processen är att ladda den konsumerbara mill bit på ett sätt så att den är fri från bubblor före dissektion (Steg 5.1). Vi har funnit att närvaron av bubblorna minskar dissektion utbyte. För att åtgärda detta problem, rekommenderar vi att framdriva och uttrycka kolven flera gånger. Användaren kan träna detta genom att lägga karamellfärg till en praxis buffert för att visualisera bubblor, som rekommenderas av tillverkaren. När effektiv, bör användaren sedan fortsätta med normal dissektion. De last kritiska steget är att dissekera provet i en moturs riktning. Maskinen bruken i moturs riktning; Därför har vi funnit att föra joysticken i en cirkulär rörelse i moturs sätt ökar vävnads avkastning som de ledande nedskärningar kant renare än bakkanten 6. Ett annat sätt att förbättra vävnads utbytet är att sänka hastigheten på dissekering processen. Vi har funnit att sätta ambitionen hastigheten och motorhastigheten på lägsta hastighet samtidigt inställning scenen hastigheten till "låg" ger den högsta vävnads avkastning. Det finns två huvudsakliga begränsningar för denna microdissection tillvägagångssätt. Den första begränsningen är att vi har hittat punkten dissektion mycket utmanande på grund av behovet att driva styrspaken i moturs cirklar i dissektion processen. Den andra begränsningen är att kameran på instrumentet genererar en bild som saknar den cellulära detalj av en bild som genereras från ett avancerat mikroskop.
Mtb. granulombildning är ett kännetecken för TB-infektion och resultat från värdens försök att innehålla patogenen inom ett begränsat område av lungan 5. Omvänt har det föreslagits att Mtb har utvecklats för att låta sin uthållighet i granulomatösa lesioner 7. Mtb utsätts för olika påfrestningar beroende på stadium av infektionen. Några av dessa påkänningar innefattar men är inte begränsade till redox-stress, lågt pH, membranskada, hypoxi, brist på näring, etc 7-13. Under alla dessa olika faser kan Mtb ändå överleva i en latent form och även återaktivera. Detta innebär att olika gener uppregleras och nedregleras vid olika infektionsstadier. Exempelvis Mtb kodar för över 200 transkriptionsfaktorer 4. Dessutom har det visats att uttrycket balans mellan olika kemokiner, framgångsh som α och β kemokiner, inom granulom kan vara viktiga markörer skydd 8. Utvärdering av mykobakteriella transkriptomik i granulomatös vävnad kommer sannolikt att öka vår förståelse för de som är involverade i deras bildning mekanismer och underhåll samt de gener som uttrycks i varje stat av infektionen. Detta ger oss möjlighet att utvärdera mykobakteriella transkriptomik i olika TB infektiösa stadier inklusive aktiv, latent och reaktiv sjukdomar samt olika regioner inom granulom själv. Förutom att tillåta oss att ytterligare utvärdera mykobakteriella transkriptomik, ovanstående procedur möjliggör också för bedömningen av värd transkriptomik i samma smittländerna. Dessutom är denna metod sedan kan användas för att jämföra, kontrast och analysera förhållandet mellan värd och bakterier.
Även om ett viktigt verktyg i tuberkulosforskning, kan det ovannämnda protokollet tillämpas på andra patogener också. Ovanståendeprotokollet använder FFPE diabilder från infekterade lungprover, men kan också appliceras på lesioner från andra organ. Vi visar hur man använder systemet för att extrahera RNA, men det kan i teorin användas för DNA-och proteinutvinning på ett lika effektivt och tidskänsliga sätt. FFPE block finns i de flesta laboratorie histologi avdelningar; alltså, den teknik som beskrivs här har möjlighet att exponentiellt öka kunskap från dessa tillfället oanvända prover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna beskriver att det inte finns några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka för följande NIH utmärkelser / subawards för att stödja denna forskning: R01HL106790, R01HL106790-S1, R01HL106786, R01AI089323, R21AI091457, R21RR026006, P20RR020159, C06RR017563, 8T32OD011124-08, och P51OD011104.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MeSectr | AvanSci Bio | Mesodissector | |
| 400 nm xScisors | AvanSci Bio | Other sizes available | |
| THOR | AvanSci Bio | Programmable Heater-Shaker | |
| NanoDrop2000 | ThermoScientific | ND-2000 | |
| RNeasy FFPE extraction kit | Qiagen | 73504 | |
| Ovation RNA-Seq FFPE System | Nugen | 7150 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 |
References
- Fend, F., Raffeld, M.
- Esposito, G. Complementary techniques: laser capture microdissection--increasing specificity of gene expression profiling of cancer specimens. Adv Exp Med Biol. 593, 54-65 (2007).
- Adey, N., Bosh, D., Emery, D., Birch, L., Parry, R. Mesodissection of Paraffin Embedded Slide Mounted Tissue Sections. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (6), (2012).
- Fleischmann, R. D., Alland, D., Eisen, J. A., Carpenter, L., White, O., Peterson, J., et al. Whole-genome comparison of Mycobacterium tuberculosis clinical and laboratory strains. J Bacteriol. 184 (19), 5479-5490 (2002).
- Russell, D. G., Barry 3rd, C. E., Flynn, J. L. Tuberculosis: what we don't know can, and does, hurt us. Science. 328 (5980), 852-856 (2010).
- Paige, C., Bishai, W. R. Penitentiary or penthouse condo: the tuberculous granuloma from the microbe's point of view. Cell Microbiol. 12 (3), 301-309 (2010).
- Mehra, S., Alvarez, X., Didier, P. J., Doyle, L. A., Blanchard, J. L., Lackner, A. A., et al. Granuloma correlates of protection against tuberculosis and mechanisms of immune modulation by Mycobacterium tuberculosis. J Infect Dis. 207 (7), 1115-1127 (2013).
- Kaushal, D., Schroeder, B. G., Tyagi, S., Yoshimatsu, T., Scott, C., Ko, C., et al. Reduced immunopathology and mortality despite tissue persistence in a Mycobacterium tuberculosis mutant lacking alternative sigma factor, SigH. Proc Natl Acad Sci U S A. (12), 8330-8335 (2002).
- Mehra, S., Kaushal, D. Functional genomics reveals extended roles of the Mycobacterium tuberculosis stress response factor sigmaH. J Bacteriol. 191 (12), 3965-3980 (2009).
- Rohde, K. H., Veiga, D. F., Caldwell, S., Balazsi, G., Russell, D. G. Linking the transcriptional profiles and the physiological states of Mycobacterium tuberculosis during an extended intracellular infection. PLoS Pathog. 8 (6), (2012).
- Fontan, P. A., Voskuil, M. I., Gomez, M., Tan, D., Pardini, M., Manganelli, R., et al. The Mycobacterium tuberculosis sigma factor sigmaB is required for full response to cell envelope stress and hypoxia in vitro, but it is dispensable for in vivo growth. J Bacteriol. 191 (18), 5628-5633 (2009).
- Rustad, T. R., Harrell, M. I., Liao, R., Sherman, D. R. The enduring hypoxic response of Mycobacterium tuberculosis. PLoS One. 3 (1), (2008).
Tags
Immunologi Microdissection mesodissection formalin fast paraffin inbäddad,Erratum
Formal Correction: Erratum: A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas
Posted by JoVE Editors on 07/01/2014.
Citeable Link.
The corresponding author was changed for the article, A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas. The corresponding author was changed from:
Teresa A. Hudock
to:
Deepak Kaushal
