Analisi Metabolomica di cervello di ratto da Alta Risoluzione Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare di estratti di tessuto

Summary

The neurochemistry of mammalian brain is changed in many neurological and systemic diseases. Characteristic profiles of cerebral metabolites can be efficiently obtained based on crude extracts of brain tissue. To this end, high-resolution NMR spectroscopy is employed, enabling detailed quantitative analysis of metabolite concentrations (metabolomics).

Abstract

Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics and proteomics have been complemented by comprehensive quantitative analysis of the metabolite pool present in biological systems. This strategy, termed metabolomics, strives to provide a global characterization of the small-molecule complement involved in metabolism. While the genome and the proteome define the tasks cells can perform, the metabolome is part of the actual phenotype. Among the methods currently used in metabolomics, spectroscopic techniques are of special interest because they allow one to simultaneously analyze a large number of metabolites without prior selection for specific biochemical pathways, thus enabling a broad unbiased approach. Here, an optimized experimental protocol for metabolomic analysis by high-resolution NMR spectroscopy is presented, which is the method of choice for efficient quantification of tissue metabolites. Important strengths of this method are (i) the use of crude extracts, without the need to purify the sample and/or separate metabolites; (ii) the intrinsically quantitative nature of NMR, permitting quantitation of all metabolites represented by an NMR spectrum with one reference compound only; and (iii) the nondestructive nature of NMR enabling repeated use of the same sample for multiple measurements. The dynamic range of metabolite concentrations that can be covered is considerable due to the linear response of NMR signals, although metabolites occurring at extremely low concentrations may be difficult to detect. For the least abundant compounds, the highly sensitive mass spectrometry method may be advantageous although this technique requires more intricate sample preparation and quantification procedures than NMR spectroscopy. We present here an NMR protocol adjusted to rat brain analysis; however, the same protocol can be applied to other tissues with minor modifications.

Introduction

Modelli murini sono stati utilizzati estesamente nella ricerca sul cervello ^1. Correlazioni genotipo-fenotipo sono stati studiati nel topo e ratto cervello studiando l'espressione genica a RNA e / o livelli di proteine ​​da un lato, e fenotipi morfologici, funzionali, elettrofisiologiche e / o comportamentali dall'altro ^2-6. Tuttavia, per comprendere completamente i meccanismi che collegano fenotipo al genotipo, è indispensabile studiare gli eventi molecolari a valle di espressione della proteina, cioè. il metabolismo dei substrati biochimici su cui agiscono gli enzimi ^7. Questa esigenza ha portato, nel corso degli ultimi 10 o 15 anni, a una rinascita della ricerca metabolica in molti rami della biologia ^8,9. Mentre studi metabolici classici si sono spesso concentrati su dettagli di specifici percorsi, il nuovo approccio metabolomica è orientata verso un'indagine onnicomprensiva del profilo metabolico globale del tessuto in esame.Una conseguenza di questo concetto è un evidente bisogno di strumenti analitici che riducono al minimo pregiudizio verso specifici percorsi e / o classi di composti metabolici. Tuttavia, un saggio biochimico classica è basata su una particolare reazione chimica di un analita che deve essere specificato prima di eseguire il test. Per contro, tecniche spettroscopiche come la risonanza magnetica (NMR) nucleare e la spettrometria di massa (MS) (i) sono basati su particolari (fisici) proprietà molecolari di composti biochimici, ciascuna delle quali dà luogo ad uno o più segnali distinti in uno spettro rilevato nel corso di un esperimento; e (ii) rilevare un gran numero di diversi composti per esperimento.

Così, ogni spettro contiene le informazioni combinate di tutta una serie di metaboliti. Per questo motivo, i metodi spettroscopici sono strumenti adeguati per la metabolomica, in quanto nessuna selezione preventiva deve essere fatta per quanto riguarda la natura dell'analita da misurare ⁸ </sup>. Di conseguenza, queste tecniche naturalmente si prestano a studi esplorativi perché notevolmente facilitano l'individuazione di cambiamenti metabolici inaspettati.

Anche se la spettroscopia NMR e MS possono essere usati in modo intercambiabile per l'analisi di molti metaboliti, ogni metodo possiede vantaggi e gli svantaggi che sono stati recentemente recensito ¹⁰ specifici. In breve, la spettroscopia NMR di solito può essere eseguita da estratti grezzi e non richiede la separazione cromatografica di composti del campione prima dell'analisi. Al contrario, MS funziona con gas o cromatografia liquida (GC o LC) separazione, ad eccezione di particolari sviluppi recenti come l'imaging spettrometria di massa. In alcuni casi particolari, come l'analisi degli zuccheri, separazione LC può diventare una necessità per la spettroscopia NMR così, perché le linee di risonanza di zuccheri diversi si sovrappongono in modo significativo nel protone ⁽¹ H) spettri NMR. Tuttavia, spettroscopia ¹ H NMR senza chrseparazione omatographic rimane il più popolare quasi universalmente applicata metodo NMR metabolomica,. In generale, la preparazione del campione è più lungo e complesso per MS di quanto lo sia per la spettroscopia NMR. Gravi problemi dovuti agli effetti della matrice sono molto meno comuni in spettroscopia NMR che in Stati membri in cui essi possono condurre a segnali notevolmente attenuati. Metabolita quantificazione può essere ottenuto con entrambi i metodi. Tuttavia, sono necessari più composti standard per la SM a causa di variazioni di effetti matrice e l'efficienza di ionizzazione tra metaboliti. Al contrario, è necessario un solo standard per ogni campione per l'analisi spettroscopica NMR perché in condizioni di misura adeguate, il secondo metodo è intrinsecamente quantitative grazie alla risposta NMR strettamente lineare dai nuclei osservati. Un grave inconveniente di NMR è la sua relativamente bassa sensibilità. MS, in particolare, LC-MS, è più sensibile NMR di diversi ordini di grandezza; per questo motivo, MS è da preferire NMR per laanalisi dei composti presenti a concentrazioni molto basse. D'altra parte, la natura non distruttiva dell'esperimento NMR è un chiaro vantaggio rispetto MS; in questo modo, NMR può essere eseguita più volte sullo stesso campione, ad esempio, per i diversi nuclei NMR attivo come ¹ H, fosforo-31 ⁽³¹ P), carbonio-13 ⁽¹³ C), fluoro-19 ⁽¹⁹ F) etc., in quanto nessun materiale viene consumato da NMR rispetto alle misurazioni MS.

Sia NMR e MS possono essere impiegati in modi differenti, ognuno dei quali è ottimale per la rivelazione di composti con particolari caratteristiche chimiche. Per esempio, ³¹ P NMR è spesso più adatto di ¹ H NMR per l'analisi di composti fosforilati moderatamente concentrati, sebbene metaboliti fosforilati quasi tutti contengono anche protoni. Tuttavia, i loro segnali ¹ H NMR possono essere oscurate da ¹ H NMR i segnali provenienti da altri composti, non fosforilata, mentre il secondoovviamente non causano segnali di fondo in ³¹ P NMR. In una situazione analogico, analisi ¹⁹ F NMR è da preferire per i composti fluorurati, ad esempio, farmaci fluorurati (nessun segnale di fondo di metaboliti endogeni), mentre il caso speciale di ¹³ C NMR è di interesse quasi esclusivamente se il destino di ¹³ C deve essere seguita, a causa della estremamente bassa abbondanza naturale dell'isotopo ¹³ C (circa 1%) etichettati precursori metabolici esogeni. Molti spettrometri di massa operano in modalità ioni negativi o in modalità ioni positivi. Pertanto, è importante conoscere in anticipo l'analisi se gli ioni da osservare sono caricati negativamente o positivamente. Ci concentriamo qui su un protocollo per l'analisi del metabolome tessuto cerebrale da ¹ H e ³¹ spettroscopia NMR P perché questo metodo produce un gran numero di importanti concentrazioni di metaboliti a basso costo, in termini di (i) il tempo necessario per la preparazione del campione unnd (ii) lo sforzo richiesto per metabolita quantificazione. Tutti gli esperimenti possono essere eseguiti utilizzando l'attrezzatura di un laboratorio standard di wet-chimica e una struttura di spettroscopia NMR ad alta risoluzione. Ulteriori requisiti sono descritti nella sezione Protocollo di seguito.

Protocol

NOTA: ANIMAL DICHIARAZIONE ETICA Gli studi sugli animali sui ratti hanno seguito le linee guida vigenti in Francia, e sono stati approvati dal Comitato Etico locale (# 40.04, Università di Aix-Marseille Medical School, Marsiglia, Francia). 1 raccolta e congelamento Rat Brain Preparare articoli richiesti: azoto liquido (N 2liq.) In Dewar che è grande abbastanza per mantenere un morsetto di congelamento (almeno 2-3 L di volume); anestetico (ad esempio, i…

Representative Results

Per ottenere la migliore risoluzione in metabolica spettri NMR di cervello e di altri estratti tissutali, è stato a lungo una pratica comune per rimuovere o ioni metallici (maschera più importante: ioni paramagnetici) presenti nelle soluzioni di estratto. Ciò è stato ottenuto mediante aggiunta di un agente chelante come EDTA o CDTA all'estratto 19, o facendo passare l'estratto attraverso una resina a scambio ionico, come Chelex-100 20. I risultati presentati in Figura 1,</strong…

Discussion

Spettroscopia NMR è un metodo efficiente per la misurazione delle concentrazioni di composti chimici in soluzione in modo molto accurato e riproducibile. Tuttavia, per ottenere dati di alta qualità, è necessario rispettare alcune norme in materia di preparazione e analisi del campione. Nella determinazione di concentrazioni di metaboliti mediante spettroscopia NMR, né la generazione né la ricezione del segnale NMR domina l'errore di quantificazione, a meno che l'intensità di un segnale osservato avvicina a…

Materials

Isoflurane	Virbac	Vetflurane	Anesthetic for animals
Isoflurane vaporizer	Ohmeda	Isotec 3	Newer model available: Isotec 4
Scalpel, scissors, forceps, clamps	Harvard Apparatus Fisher Scientific	various various	Surgical equipment for animals
Freeze-clamp tool	homebuilt	n/a	Tong with aluminium plates, to be inserted in liquid nitrogen for cooling
Dewar	Nalgene	4150-4000
Liquid nitrogen	Air Liquide	n/a
Nitrogen gas	Air Liquide	n/a
Nitrogen evaporator	Organomation Associates	N-EVAP 111	Can be replaced by homebuilt device
Mortar	Sigma-Aldrich	Z247472
Pestle	Sigma-Aldrich	Z247510
Tissue homogenizer	Kinematica	Polytron	With test tubes fitting homogenizer shaft
Electronic scale	Sartorius	n/a
Methanol	Sigma-Aldrich	M3641
Chloroform	Sigma-Aldrich	366910
Glass centrifuge tubes	Kimble	45500-15, 45500-30	Kimax 15-mL, 30-mL tube
Microcentrifuge tubes	Kimble	45150-2	Kimax 2-mL tube; should replace "Eppen-dorf" tube if compatible with centrifuge rotor
polystyrene pipettes	Costar Corning	Stripettes	5 and 10-mL volumes
Deuterochloroform	Sigma-Aldrich	431915	99.96 % deuterated
Deuterium oxide	Sigma-Aldrich	423459	99.96 % deuterated
Deuterium chloride	Alpha Aesar	42406	20 % in deuterium oxide
Sodium deuteroxide	Sigma-Aldrich	164488	30 % in deuterium oxide
Lyophilizer	Christ	Alpha 1-2
Cold centrifuge	Heraeus	Megafuge 16R
pH meter	Eutech Cybernetics	Cyberscan
CDTA	Sigma-Aldrich	D0922
Cesium hydroxide	Sigma-Aldrich	516988
NMR tubes	Wilmad	528-PP
NMR stem coaxial insert	Sigma-Aldrich	Z278513	By Wilmad
NMR pipettes	Sigma-Aldrich	Z255688
Pipettes	Eppendorf	연구	With tips for volumes from 0.5 to 1000 μL
Pipet-Aid	Drummond	XP
NMR spectrometer	Bruker	AVANCE 400	including probe and other accessories
NMR software	Bruker	TopSpin 1.3	newer version available: Topspin 3.2
Water-soluble standard compounds	Sigma-Aldrich	various
Phospholipid standard compounds	Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich	various various various	Source for plasmalogens, but may be < 70 – 80 % purity
Methylenediphosphonate	Sigma-Aldrich	M9508
TSP-d4	Sigma-Aldrich	269913