조직 추출물의 고해상도 핵 자기 공명 분광법에 의한 쥐 뇌의 대사 체 분석
Summary
The neurochemistry of mammalian brain is changed in many neurological and systemic diseases. Characteristic profiles of cerebral metabolites can be efficiently obtained based on crude extracts of brain tissue. To this end, high-resolution NMR spectroscopy is employed, enabling detailed quantitative analysis of metabolite concentrations (metabolomics).
Abstract
Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics and proteomics have been complemented by comprehensive quantitative analysis of the metabolite pool present in biological systems. This strategy, termed metabolomics, strives to provide a global characterization of the small-molecule complement involved in metabolism. While the genome and the proteome define the tasks cells can perform, the metabolome is part of the actual phenotype. Among the methods currently used in metabolomics, spectroscopic techniques are of special interest because they allow one to simultaneously analyze a large number of metabolites without prior selection for specific biochemical pathways, thus enabling a broad unbiased approach. Here, an optimized experimental protocol for metabolomic analysis by high-resolution NMR spectroscopy is presented, which is the method of choice for efficient quantification of tissue metabolites. Important strengths of this method are (i) the use of crude extracts, without the need to purify the sample and/or separate metabolites; (ii) the intrinsically quantitative nature of NMR, permitting quantitation of all metabolites represented by an NMR spectrum with one reference compound only; and (iii) the nondestructive nature of NMR enabling repeated use of the same sample for multiple measurements. The dynamic range of metabolite concentrations that can be covered is considerable due to the linear response of NMR signals, although metabolites occurring at extremely low concentrations may be difficult to detect. For the least abundant compounds, the highly sensitive mass spectrometry method may be advantageous although this technique requires more intricate sample preparation and quantification procedures than NMR spectroscopy. We present here an NMR protocol adjusted to rat brain analysis; however, the same protocol can be applied to other tissues with minor modifications.
Introduction
쥐 모델은 뇌 연구 1에서 광범위하게 활용되고있다. 유전자형 표현형 상관 관계는 다른 2-6 한편 RNA 및 / 또는 단백질 수준에서 유전자 발현을 연구함으로써, 마우스 및 래트의 뇌에 조사하고, 형태 학적 기능, 전기 생리 학적 및 / 또는 행동 적 표현형되었다. 그러나, 완전히 유전자형 표현형에 연결 메커니즘을 이해하기 위해서는 하류 단백질 발현, 즉 분자의 사건을 조사하는 것이 필수적이다. 효소는 7 행동을 두는 생화학 기판의 신진 대사. 이 요구 사항은 생물학 8,9의 여러 가지 대사 연구의 르네상스로 지난 10-15년 이상했다. 고전 대사 연구는 종종 특정 경로의 상세에 집중되었지만, 새로운 메타 볼로 접근법 고려 조직의 대사 프로파일의 글로벌 모두 포괄 맞도록 조사된다.이 개념 중 하나 결과는 특정 대사 경로 및 / 또는 화합물의 클래스에 대한 편견을 최소화 분석 도구에 대한 명백한 필요합니다. 그러나, 전통적인 생화학 적 분석은 분석이 수행되기 전에 지정해야 특정 분석 물의 특정 화학 반응에 기초한다. 대조적으로, 핵 자기 공명 (NMR) 분광법 및 질량 분석법 (MS) (I)와 같은 광학적 기술은 생화학 물질, 특정 분자 (물리적) 특성을 기반으로는 각각의 스펙트럼에있어서, 하나 또는 다수의 별개의 신호를 일으킨다 한 실험 과정에서 검출; 및 (ⅱ) 실험마다 상이한 다수의 화합물을 검출한다.
따라서, 각각의 스펙트럼은 대사 산물의 전체 범위의 결합 된 정보가 포함되어 있습니다. 더 이전의 선택은 피 분석의 특성에 관한 8 측정 할 할 필요가 없기 때문에 이러한 이유로, 분 광학적 방법은 대사 체학을위한 적절한 툴, 아르 </sup>. 그들은 매우 예기치 대사 변화의 검출을 용이하게하기 때문에 결과적으로, 이들 기술은 자연 탐색 연구에는 적합.
NMR 분광기 및 MS는 많은 대사 분석을 위해 상호 교환 적으로 사용될 수 있지만, 각각의 방법은 특정의 장점과 최근 10를 평가 한 단점을 가지고있다. 간단히, NMR 분광법은 보통 조 추출물에서 수행 할 수 있으며, 분석하기 전에 샘플 화합물을 크로마토 그래피 분리를 필요로하지 않는다. 반면, MS는 질량 분석 이미징 특히 최근 개발을 제외하고, 기체 또는 액체 크로마토 그래피 (GC 또는 LC) 분리와 함께 작동합니다. 다른 당의 공진 라인 (1 H) 양성자 NMR 스펙트럼에서 상당히 중첩 때문에 이러한 당의 분석과 같은 몇몇 특별한 경우에서, LC 분리는 물론 NMR 분광법에 대한 필요성이 될 수있다. CHR없이 그럼에도 1 H NMR 분광법omatographic 분리는 가장 인기있는 거의 보편적으로 적용 메타 볼로 NMR 방법 남아있다. 일반적으로, 샘플 준비는 NMR 분광법에 대해 MS보다 더 많은 시간이 걸리고 복잡한이다. 매트릭스 효과로 인해 심각한 문제가 많은가 상당히 약화 신호로 이어질 수있는 위치 MS보다 NMR 분광법 덜 일반적이다. 대사 정량은 어느 방법으로 달성 될 수있다. 그러나, 여러 표준 화합물 인해 대사 사이의 매트릭스 효과 및 이온화 효율의 변동에 MS 필요하다. 대조적으로, 샘플 당 하나의 표준 때문에 적절한 측정 조건 하에서 NMR 분광 분석에 필요한, 후자의 방법은 본질적으로 관측 핵에 의해 엄격하게 선형 응답 NMR로 정량 덕분이다. NMR의 주요 단점은 상대적으로 낮은 민감도이다. MS, 특히 LC-MS에 몇 배에 의해 NMR보다 더 민감하다; 이러한 이유로, MS는 NMR에 대해 선호 될매우 낮은 농도에서 발생하는 화합물의 분석. 한편, NMR 실험의 비파괴 특성은 MS 위에 분명한 장점은; 이러한 방식으로, NMR은 1 H, 인-31 (31 P), 탄소 -13 (13 C) 같은 다른 NMR-활성 핵 위해, 예를 들어 동일한 샘플에 반복적으로 수행 할 수있는 불소 – 19 (19 F) 등., MS 측정 반대로 어떤 물질이 NMR에 의해 소비되지 않은 것처럼.
NMR 및 MS 모두는 상이한 모드로 사용될 수 있으며, 각각의 하나는 특정의 화학적 특성을 갖는 화합물의 검출에 최적 인. 거의 모든 대사 인산화도 양자를 포함 할지라도, 예를 들어, 31 P NMR 종종 적당히 농축 인산화 분석 화합물의 1 H NMR보다 더 적합하다. 그러나, 그들의 1 H NMR 신호는 후자 반면, 다른 비 – 인산화 된 화합물 1 H NMR 신호에 의해 가려 질 수도분명히 31 P NMR 스펙트럼에서 배경 신호를 발생하지 않습니다. 13 C NMR의 특별한 경우는 거의 독점적으로 관심있는 동안 아날로그 상황에서, 19 F NMR 분석, 불소 화합물, 예를 들면, 플루오르 화 약물 (내인성 대사에서 배경 없음 신호)에 바람직 할 경우 13 C-의 운명 표시 외인성 대사 전구 물질로 인해 13 C 동위 원소 (약 1 %)의 매우 낮은 자연 풍부 따라야합니다. 많은 질량 분석기는 음이온 모드 또는 양이온 모드에서 작동합니다. 따라서, 앞서 이온이 부정적 또는 긍정적으로 청구됩니다 관찰 할 수 있는지 여부를 분석 아는 것이 중요합니다. 이 방법은 시료 준비에 필요한 (I)의 시간적으로 저비용으로 중요한 대사 산물 농도의 많은 수를 산출하기 때문에 우리는 1 H, 31 P NMR 분광법에 의한 뇌 조직의 대사 체의 분석 프로토콜에 여기에 집중차 (II) 노력은 대사 산물 정량이 필요합니다. 모든 실험은 표준 습식 화학 실험실의 장비 및 고해상도 NMR 분광법 설비를 사용하여 수행 될 수있다. 또한 요구 사항은 아래의 프로토콜 부분에 설명되어 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
NMR 분광법은 매우 정확하고 재현 가능한 방식으로 용액 화학 물질의 농도를 측정하기위한 효율적인 방법이다. 그러나, 고품질의 데이터를 얻기 위해 그 샘플 준비 및 분석에 관한 소정의 규칙에 적용하는 것이 필요하다. 관측 된 신호의 강도가 검출 임계치 (특히 약한 신호)에 접근하지 않는 NMR 분광법에 의한 대사 산물 농도의 결정에있어서, 생성이나 NMR 신호의 수신도는 정량 오류를 지배하고있…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Support by Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS, UMR 6612 and 7339) is gratefully acknowledged.
Materials
| Isoflurane | Virbac | Vetflurane | Anesthetic for animals |
| Isoflurane vaporizer | Ohmeda | Isotec 3 | Newer model available: Isotec 4 |
| Scalpel, scissors, forceps, clamps | Harvard Apparatus Fisher Scientific |
various various |
Surgical equipment for animals |
| Freeze-clamp tool | homebuilt | n/a | Tong with aluminium plates, to be inserted in liquid nitrogen for cooling |
| Dewar | Nalgene | 4150-4000 | |
| Liquid nitrogen | Air Liquide | n/a | |
| Nitrogen gas | Air Liquide | n/a | |
| Nitrogen evaporator | Organomation Associates | N-EVAP 111 | Can be replaced by homebuilt device |
| Mortar | Sigma-Aldrich | Z247472 | |
| Pestle | Sigma-Aldrich | Z247510 | |
| Tissue homogenizer | Kinematica | Polytron | With test tubes fitting homogenizer shaft |
| Electronic scale | Sartorius | n/a | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | M3641 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 366910 | |
| Glass centrifuge tubes | Kimble | 45500-15, 45500-30 | Kimax 15-mL, 30-mL tube |
| Microcentrifuge tubes | Kimble | 45150-2 | Kimax 2-mL tube; should replace "Eppen-dorf" tube if compatible with centrifuge rotor |
| polystyrene pipettes | Costar Corning | Stripettes | 5 and 10-mL volumes |
| Deuterochloroform | Sigma-Aldrich | 431915 | 99.96 % deuterated |
| Deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 423459 | 99.96 % deuterated |
| Deuterium chloride | Alpha Aesar | 42406 | 20 % in deuterium oxide |
| Sodium deuteroxide | Sigma-Aldrich | 164488 | 30 % in deuterium oxide |
| Lyophilizer | Christ | Alpha 1-2 | |
| Cold centrifuge | Heraeus | Megafuge 16R | |
| pH meter | Eutech Cybernetics | Cyberscan | |
| CDTA | Sigma-Aldrich | D0922 | |
| Cesium hydroxide | Sigma-Aldrich | 516988 | |
| NMR tubes | Wilmad | 528-PP | |
| NMR stem coaxial insert | Sigma-Aldrich | Z278513 | By Wilmad |
| NMR pipettes | Sigma-Aldrich | Z255688 | |
| Pipettes | Eppendorf | 연구 | With tips for volumes from 0.5 to 1000 μL |
| Pipet-Aid | Drummond | XP | |
| NMR spectrometer | Bruker | AVANCE 400 | including probe and other accessories |
| NMR software | Bruker | TopSpin 1.3 | newer version available: Topspin 3.2 |
| Water-soluble standard compounds | Sigma-Aldrich | various | |
| Phospholipid standard compounds | Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich |
various various various |
Source for plasmalogens, but may be < 70 – 80 % purity |
| Methylenediphosphonate | Sigma-Aldrich | M9508 | |
| TSP-d4 | Sigma-Aldrich | 269913 |
References
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