Análisis de Metabolómica de cerebro de rata por Alta Resolución Nuclear Espectroscopía de Resonancia Magnética de Extractos de Tejidos

Summary

The neurochemistry of mammalian brain is changed in many neurological and systemic diseases. Characteristic profiles of cerebral metabolites can be efficiently obtained based on crude extracts of brain tissue. To this end, high-resolution NMR spectroscopy is employed, enabling detailed quantitative analysis of metabolite concentrations (metabolomics).

Abstract

Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics and proteomics have been complemented by comprehensive quantitative analysis of the metabolite pool present in biological systems. This strategy, termed metabolomics, strives to provide a global characterization of the small-molecule complement involved in metabolism. While the genome and the proteome define the tasks cells can perform, the metabolome is part of the actual phenotype. Among the methods currently used in metabolomics, spectroscopic techniques are of special interest because they allow one to simultaneously analyze a large number of metabolites without prior selection for specific biochemical pathways, thus enabling a broad unbiased approach. Here, an optimized experimental protocol for metabolomic analysis by high-resolution NMR spectroscopy is presented, which is the method of choice for efficient quantification of tissue metabolites. Important strengths of this method are (i) the use of crude extracts, without the need to purify the sample and/or separate metabolites; (ii) the intrinsically quantitative nature of NMR, permitting quantitation of all metabolites represented by an NMR spectrum with one reference compound only; and (iii) the nondestructive nature of NMR enabling repeated use of the same sample for multiple measurements. The dynamic range of metabolite concentrations that can be covered is considerable due to the linear response of NMR signals, although metabolites occurring at extremely low concentrations may be difficult to detect. For the least abundant compounds, the highly sensitive mass spectrometry method may be advantageous although this technique requires more intricate sample preparation and quantification procedures than NMR spectroscopy. We present here an NMR protocol adjusted to rat brain analysis; however, the same protocol can be applied to other tissues with minor modifications.

Introduction

Los modelos murinos han sido utilizados ampliamente en la investigación del cerebro ^1. Correlaciones genotipo-fenotipo han sido investigados en cerebros de ratón y de rata mediante el estudio de la expresión génica en el ARN y / o los niveles de proteína, por una parte, y fenotipos morfológicos, funcionales, electrofisiológicas y / o de comportamiento en el otro ^2-6. Sin embargo, para entender completamente los mecanismos que vinculan fenotipo a genotipo, es imperativo investigar los eventos moleculares aguas abajo de la expresión de proteínas, es decir. el metabolismo de los sustratos bioquímicos sobre la que actúan las enzimas ^7. Este requisito llevó, en los últimos 10 a 15 años, a un renacimiento de la investigación metabólica en muchas ramas de la biología ^8,9. Mientras que los estudios metabólicos clásicos a menudo se han centrado en los detalles de las vías específicas, el nuevo enfoque de metabolómica está orientada a una investigación que todo lo abarca del perfil metabólico global del tejido en estudio.Una consecuencia de este concepto es evidente la necesidad de herramientas de análisis que minimizan el sesgo hacia las vías y / o clases de compuestos metabólicos específicos. Sin embargo, un ensayo bioquímico clásico se basa en una reacción química particular de un analito específico que necesita ser especificado antes de que se realiza el ensayo. Por el contrario, técnicas espectroscópicas tales como resonancia magnética (NMR) nuclear y espectrometría de masas (MS) (i) se basan en propiedades moleculares particulares (físicas) de compuestos bioquímicos, cada uno de los cuales da lugar a una o varias señales distintas en un espectro detectado en el transcurso de un experimento; y (ii) detectar un gran número de diferentes compuestos por experimento.

Por lo tanto, cada espectro contiene la información combinada de toda una gama de metabolitos. Por esta razón, métodos espectroscópicos son herramientas adecuadas para la metabolómica, como ninguna selección previa necesita ser hecha en cuanto a la naturaleza del analito a medir ⁸ </sup>. Como consecuencia, estas técnicas se prestan naturalmente a los estudios exploratorios porque facilitan en gran medida la detección de cambios metabólicos inesperados.

Aunque la espectroscopia de RMN y MS se pueden utilizar indistintamente para el análisis de muchos metabolitos, cada método tiene ventajas y desventajas de que recientemente se han revisado ¹⁰ específicos. Brevemente, la espectroscopía de RMN se puede realizar generalmente a partir de extractos crudos y no requiere separación cromatográfica de los compuestos de la muestra antes del análisis. Por el contrario, MS funciona con gas o cromatografía líquida (GC o LC) de separación, a excepción de determinados acontecimientos recientes, como la imagen de espectrometría de masas. En unos pocos casos especiales, tales como el análisis de azúcares, separación de LC puede llegar a ser una necesidad para la espectroscopia de RMN, así, porque las líneas de resonancia de diferentes azúcares se solapan significativamente en protones ⁽¹ H) Los espectros de RMN. Sin embargo, ¹ H RMN espectroscopía sin chrseparación omatographic sigue siendo el método de RMN metabolómico más popular, casi universalmente aplicada. En general, la preparación de muestras es más largo y complejo para la EM que para la espectroscopía de RMN. Los problemas graves debido a los efectos de matriz son mucho menos comunes en la espectroscopia de RMN que en MS en los que pueden dar lugar a señales considerablemente atenuadas. La cuantificación de metabolitos puede lograrse con cualquiera de los métodos. Sin embargo, se necesitan múltiples compuestos estándar para la EM, debido a las variaciones en los efectos de matriz y la eficiencia de ionización entre metabolitos. Por el contrario, sólo se necesita un estándar por muestra para un análisis espectroscópico de RMN porque bajo condiciones de medición adecuadas, el último método es intrínsecamente gracias cuantitativos a la respuesta RMN estrictamente lineal por los núcleos observados. Un inconveniente importante de RMN es su sensibilidad relativamente baja. MS, en particular, LC-MS, es más sensible que la RMN en varios órdenes de magnitud; por esta razón, MS es preferible más de RMN para elanálisis de compuestos que se producen a concentraciones muy bajas. Por otro lado, la naturaleza no destructiva del experimento de RMN es una clara ventaja sobre MS; de esta manera, RMN se puede realizar varias veces sobre la misma muestra, por ejemplo, para diferentes núcleos-RMN activo tal como ¹ H, fósforo-31 ⁽³¹ P), carbono-13 (C ^13), flúor-19 ⁽¹⁹ F) etc., ya que ningún material se consume por NMR en comparación con las mediciones de EM.

Tanto RMN y MS se pueden emplear en diferentes modos, cada uno de ellos sea óptima para la detección de compuestos con características químicas particulares. Por ejemplo, ³¹ P RMN es a menudo más adecuado que ¹ H RMN para el análisis de compuestos fosforilados moderadamente concentradas, aunque casi todos los metabolitos fosforilados también contienen protones. Sin embargo, sus señales de ¹ H RMN pueden ser oscurecidos por ¹ H NMR señales de otros compuestos, no fosforilados, mientras que el segundoobviamente no causan señales de fondo en ³¹ P espectros de RMN. En una situación analógica, ¹⁹ F análisis de RMN es preferible para los compuestos fluorados, por ejemplo, medicamentos fluorados (no hay señales de fondo de metabolitos endógenos), mientras que el caso especial de ¹³ C RMN es de interés casi exclusivamente si el destino de ¹³ C precursores metabólicos exógenos marcados necesita ser seguido, debido a la extremadamente baja abundancia natural del isótopo ¹³ C (ca. 1%). Muchos espectrómetros de masas funcionan tanto en modo de ion negativo o modo de ion positivo. Por lo tanto, es importante saber de antemano el análisis de si los iones que se deben observar están cargados negativamente o positivamente. Nos centramos aquí en un protocolo para el análisis del metaboloma tejido cerebral por ¹ H y ³¹ P espectroscopía de RMN ya que este método se obtiene un gran número de concentraciones de metabolitos importantes a bajo costo en términos de (i) el tiempo necesario para la preparación de muestras de unnd (ii) el esfuerzo requerido para la cuantificación de metabolitos. Todos los experimentos se pueden realizar utilizando el equipo de un laboratorio húmedo química estándar y una instalación de espectroscopia de RMN de alta resolución. Otros requisitos se describen en la sección Protocolo de abajo.

Protocol

NOTA: ANIMAL ÉTICA DECLARACIÓN Los estudios en animales con ratas siguieron las directrices vigentes en Francia, y fueron aprobados por el Comité de Ética local (# 40.04, Universidad de la Escuela de Medicina Aix-Marseille, Marsella, Francia). 1. recolección y congelación de cerebro de rata Preparar elementos necesarios: el nitrógeno líquido (N 2liq.) En Dewar que es lo suficientemente grande como para mantener una abrazadera de congelación (al menos 2-3…

Representative Results

Para obtener mejor resolución en los espectros de RMN metabólica de cerebro y otros extractos de tejidos, se ha sido durante mucho tiempo una práctica común para eliminar iones o máscara de metal (lo más importante: iones paramagnéticos) presentes en soluciones de extracto. Esto se ha logrado ya sea mediante la adición de un agente quelante tal como EDTA o CDTA al extracto 19, o haciendo pasar el extracto a través de una resina de intercambio iónico tal como Chelex-100 20. Los resultados …

Discussion

Espectroscopía de RMN es un método eficiente para la medición de concentraciones de compuestos químicos en solución de una manera muy reproducible y precisa. Sin embargo, para obtener datos de alta calidad, es necesario cumplir con ciertas normas relativas a la preparación y análisis de muestras. En la determinación de las concentraciones de metabolitos por espectroscopía de RMN, ni la generación ni la recepción de la señal de RMN domina el error de cuantificación, a menos que la intensidad de una señal ob…

Materials

Isoflurane	Virbac	Vetflurane	Anesthetic for animals
Isoflurane vaporizer	Ohmeda	Isotec 3	Newer model available: Isotec 4
Scalpel, scissors, forceps, clamps	Harvard Apparatus Fisher Scientific	various various	Surgical equipment for animals
Freeze-clamp tool	homebuilt	n/a	Tong with aluminium plates, to be inserted in liquid nitrogen for cooling
Dewar	Nalgene	4150-4000
Liquid nitrogen	Air Liquide	n/a
Nitrogen gas	Air Liquide	n/a
Nitrogen evaporator	Organomation Associates	N-EVAP 111	Can be replaced by homebuilt device
Mortar	Sigma-Aldrich	Z247472
Pestle	Sigma-Aldrich	Z247510
Tissue homogenizer	Kinematica	Polytron	With test tubes fitting homogenizer shaft
Electronic scale	Sartorius	n/a
Methanol	Sigma-Aldrich	M3641
Chloroform	Sigma-Aldrich	366910
Glass centrifuge tubes	Kimble	45500-15, 45500-30	Kimax 15-mL, 30-mL tube
Microcentrifuge tubes	Kimble	45150-2	Kimax 2-mL tube; should replace "Eppen-dorf" tube if compatible with centrifuge rotor
polystyrene pipettes	Costar Corning	Stripettes	5 and 10-mL volumes
Deuterochloroform	Sigma-Aldrich	431915	99.96 % deuterated
Deuterium oxide	Sigma-Aldrich	423459	99.96 % deuterated
Deuterium chloride	Alpha Aesar	42406	20 % in deuterium oxide
Sodium deuteroxide	Sigma-Aldrich	164488	30 % in deuterium oxide
Lyophilizer	Christ	Alpha 1-2
Cold centrifuge	Heraeus	Megafuge 16R
pH meter	Eutech Cybernetics	Cyberscan
CDTA	Sigma-Aldrich	D0922
Cesium hydroxide	Sigma-Aldrich	516988
NMR tubes	Wilmad	528-PP
NMR stem coaxial insert	Sigma-Aldrich	Z278513	By Wilmad
NMR pipettes	Sigma-Aldrich	Z255688
Pipettes	Eppendorf	연구	With tips for volumes from 0.5 to 1000 μL
Pipet-Aid	Drummond	XP
NMR spectrometer	Bruker	AVANCE 400	including probe and other accessories
NMR software	Bruker	TopSpin 1.3	newer version available: Topspin 3.2
Water-soluble standard compounds	Sigma-Aldrich	various
Phospholipid standard compounds	Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich	various various various	Source for plasmalogens, but may be < 70 – 80 % purity
Methylenediphosphonate	Sigma-Aldrich	M9508
TSP-d4	Sigma-Aldrich	269913