Doku Esansı Yüksek Çözünürlük Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi ile Sıçan Beyin metabolomic Analizi

Summary

The neurochemistry of mammalian brain is changed in many neurological and systemic diseases. Characteristic profiles of cerebral metabolites can be efficiently obtained based on crude extracts of brain tissue. To this end, high-resolution NMR spectroscopy is employed, enabling detailed quantitative analysis of metabolite concentrations (metabolomics).

Abstract

Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics and proteomics have been complemented by comprehensive quantitative analysis of the metabolite pool present in biological systems. This strategy, termed metabolomics, strives to provide a global characterization of the small-molecule complement involved in metabolism. While the genome and the proteome define the tasks cells can perform, the metabolome is part of the actual phenotype. Among the methods currently used in metabolomics, spectroscopic techniques are of special interest because they allow one to simultaneously analyze a large number of metabolites without prior selection for specific biochemical pathways, thus enabling a broad unbiased approach. Here, an optimized experimental protocol for metabolomic analysis by high-resolution NMR spectroscopy is presented, which is the method of choice for efficient quantification of tissue metabolites. Important strengths of this method are (i) the use of crude extracts, without the need to purify the sample and/or separate metabolites; (ii) the intrinsically quantitative nature of NMR, permitting quantitation of all metabolites represented by an NMR spectrum with one reference compound only; and (iii) the nondestructive nature of NMR enabling repeated use of the same sample for multiple measurements. The dynamic range of metabolite concentrations that can be covered is considerable due to the linear response of NMR signals, although metabolites occurring at extremely low concentrations may be difficult to detect. For the least abundant compounds, the highly sensitive mass spectrometry method may be advantageous although this technique requires more intricate sample preparation and quantification procedures than NMR spectroscopy. We present here an NMR protocol adjusted to rat brain analysis; however, the same protocol can be applied to other tissues with minor modifications.

Introduction

Murin modeller beyin araştırması ¹ yaygın olarak kullanılmıştır. Genotip-fenotip, diğer korelasyon ^2-6 üzerinde, bir yandan, RNA ve / veya protein seviyelerde gen ifadesinin inceleyerek fare ve sıçan beyinleri incelenmiş ve morfolojik fonksiyonel elektrofizyolojik ve / veya davranış fenotipleri edilmiştir. Ancak, tamamen genotipi ile fenotipi bağlayan mekanizmalarını anlamak için, o aşağı protein ifadesi, yani moleküler olayları araştırmak için zorunludur. enzimler ⁷ hareket bunun üzerine biyokimyasal substratların metabolizması. Bu gereklilik biyoloji ^8,9 birçok dalında metabolik araştırma rönesans için, son 10 ila 15 yıl içinde, yol açtı. Klasik metabolik çalışmalar genellikle belirli yolların ayrıntıları odaklanmış olsa da, yeni metabolomic yaklaşım göz altında dokusunun küresel metabolik profilinin her şeyi kapsayan bir soruşturma yönelikse.Bu kavram bir sonucu özel metabolik yolları ve / veya bileşiklerin sınıflarına karşı verevi en aza indirmek analitik araçlar için açık bir ihtiyaç vardır. Bununla birlikte, klasik biyokimyasal analizi deneyi gerçekleştirilir önce belirtilmesi gereken belirli bir analit bir kimyasal reaksiyona dayanır. Bunun aksine, nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopi ve kütle spektrometrisi (MS) (i) spektroskopik teknikler biyokimyasal bileşiklerin, özellikle molekül (fiziksel) özelliklerine dayanır her biri bir spektrum içinde bir ya da birden fazla farklı sinyal yol açar bir deney sırasında tespit edilmiştir; ve (ii), deney başına farklı bileşiklerin çok sayıda tespit eder.

Böylece, her bir spektrum metabolitlerin bir dizi kombine bilgileri içerir. Önceden seçme analitin doğası ile ilgili ⁸ ölçülecek yapılması gereken Bu nedenle, spektroskopik yöntemler, metabolitler için uygun araçlardır </sus>. Bunlar büyük ölçüde beklenmedik metabolik değişimlerin saptanmasını kolaylaştırmak için bir sonucu olarak, bu teknikler, doğal keşif çalışmaları kendilerini katmaktadır.

NMR ve MS spektroskopi birçok metabolitlerin analizi için birbirlerinin yerine kullanılabilir, ancak her iki yöntemle de avantaj ve yakın zamanda gözden geçirilmiştir ¹⁰ dezavantajları da vardır. Kısaca, NMR spektroskopi, genellikle kaba özütündeki gerçekleştirilebilir ve analizden önce örnek bileşiklerin kromatografik ayırmaya gerek yoktur. Buna göre, MS gibi kütle spektrometresi görüntüleme gibi belirli son gelişmelerin dışında, gaz veya sıvı kromatografisi (GC veya LC) ayrılması ile çalışır. Farklı şekerlerin rezonans hatları ^(1H) NMR spektrası, proton aktif rol oynamaktadır, çünkü bu tür şekerlerin analizi bir kaç özel durumda, LC ayırma, hem de NMR spektroskopi için bir zorunluluk olabilir. CHR olmadan Bununla birlikte, ^1H-NMR spektroskopisiomatographic ayırma en popüler, neredeyse evrensel uygulamalı metabolomic NMR yöntemi kalır. Genel olarak, bu numune hazırlama NMR spektroskopisi için olduğu gibi, MS daha zaman alıcı ve karmaşıktır. Matriks etkileri nedeniyle ciddi sorunlar çok onlar oldukça zayıflatılmış sinyallerine neden olabilir nerede MS daha NMR spektroskopisi az yaygındır. Metabolit niceleme Her iki yöntem ile elde edilebilir. Bununla birlikte, çoklu standart bileşiklerin, metabolitleri arasında matriks etkileri ve iyonizasyon verimliliği varyasyonlara MS için gereklidir. Buna karşılık, numune başına sadece bir standart için uygun ölçüm koşulları altında, bir NMR spektroskopisi ile analiz için gerekli olan, ikinci yöntem ise esas olarak gözlenen çekirdekleri tarafından kesinlikle lineer tepki NMR nicel sayesinde. NMR önemli bir dezavantajı nispeten düşük hassasiyettir. MS, özellikle LC-MS, büyüklük birkaç emir tarafından NMR daha duyarlıdır; Bu nedenle, MS için NMR fazla tercih edilmelidirçok düşük konsantrasyonlarda meydana gelen bileşiklerin analizi. Öte yandan, bir NMR deneyinde bozulmayan doğası MS üzerinde açık bir avantaj olan; Bu şekilde, örneğin ¹ H-NMR, fosfor-31 ⁽³¹ p), karbon-13 ⁽¹³ ° C), farklı NMR aktif çekirdekleri için, örneğin, aynı numune üzerinde tekrar tekrar yapılabilir flor-19 ⁽¹⁹ C) vb., MS ölçümleri karşı önemli bir NMR ile tüketilir gibi.

NMR ve MS hem farklı modlarda kullanılabilir, her biri özel bir kimyasal özelliklere sahip bileşiklerin tespit edilmesi için uygun olan. Hemen hemen tüm fosforlu metabolitleri de protonlar ihtiva eden, ancak, örneğin, ^31P NMR, genellikle orta konsantre fosforlu bileşiklerin analizi için ^1H NMR göre daha uygundur. Ancak, ^1H NMR sinyalleri ise ikinci, diğer fosforilatlanmamış bileşiklerinden ^1H NMR sinyallerinin tarafından gizlenmiş edilebilirAçıkçası ^31P NMR spektrumlarda arka plan sinyallerini neden olmaz. ^13C NMR özel durum neredeyse sadece ilgi ise analog durumda, ¹⁹ NMR analizi, florlanmış bileşikler, örneğin, florinlenmiş ilaçlar (endojen metabolit herhangi bir arka plan sinyalleri) için tercih edilecek ise ^{13 C} kaderi Eksojen etiketli metabolik ön yüzünden ¹³ C izotopu (yaklaşık% 1), son derece düşük bir doğal bolluğu, takip edilmelidir. Birçok kütle spektrometreleri da negatif iyon modunda ya pozitif iyon modunda ya da çalışır. Bu nedenle önümüzdeki iyonlar negatif veya pozitif yüklü hale gelen dikkat edilmesi olup analiz bilmek önemlidir. Bu yöntem örnek hazırlama a için gerekli (I) 'in zaman açısından düşük maliyetle önemli metabolit konsantrasyonları çok sayıda verir çünkü ^{1H ve31P} NMR spektroskopi ile beyin dokusu metabolome analizi için bir protokol burada odaknd, (ii) bir çaba metabolit miktarının belirlenmesi için gerekli. Bütün deneyler, standart bir ıslak-kimya laboratuvar ekipman ve yüksek resolüsyon NMR spektroskopisi odası kullanılarak da gerçekleştirilebilir. Bundan başka değişiklikler aşağıdaki protokol kısmında açıklanmaktadır.

Protocol

NOT: HAYVAN ETİK BEYANI Sıçanlarda Hayvan çalışmaları Fransa'da geçerli yönergeleri takip ve Yerel Etik Kurulu (# 40.04, Aix-Marseille Üniversitesi Tıp Fakültesi, Marsilya, Fransa) tarafından onaylanmıştır. 1. Hasat ve Rat Beyin Donma Gerekli öğeleri hazırlayın: Sıvı azot (N 2liq.) Dewar bir dondurma kelepçe (en azından 2-3 L hacim) tutmak için yeterince büyük olduğunu; anestetik (örneğin, izofluran, ya da, ketamin / ksi…

Representative Results

Özü çözümler mevcut: beyin ve diğer doku özleri metabolik NMR spektrumları iyi çözünürlük elde etmek için, uzun kaldırmak veya (paramanyetik iyonlar en önemlisi) maske metal iyonları yaygın bir uygulama olmuştur. Bu, ya da Chelex-100 20 gibi bir iyon alışveriş reçinesi ile özü geçirilerek, ekstre 19, EDTA veya CDTA gibi bir kenetleme maddesinin ilave edilmesi yoluyla elde edilmiştir. Şekil 1'de sunulan sonuçlar, beyin ekstreleri dikkatli bir şekild…

Discussion

NMR spektroskopisi, bir çok yeniden üretilebilir ve doğru bir şekilde çözelti içinde kimyasal bileşiklerin konsantrasyonlarının ölçülmesi için etkili bir yöntemdir. Ancak, yüksek kalitede veri elde etmek için bu örnek hazırlama ve analizleri konusunda belirli kurallara uymak gereklidir. Gözlemlenen bir sinyalin yoğunluğu algılama eşiğini (özellikle zayıf sinyal) yaklaşımları edilmiştir, NMR spektroskopi ile metabolit konsantrasyonlarının belirlenmesinde, üretim ya NMR sinyalinin alım d…

Materials

Isoflurane	Virbac	Vetflurane	Anesthetic for animals
Isoflurane vaporizer	Ohmeda	Isotec 3	Newer model available: Isotec 4
Scalpel, scissors, forceps, clamps	Harvard Apparatus Fisher Scientific	various various	Surgical equipment for animals
Freeze-clamp tool	homebuilt	n/a	Tong with aluminium plates, to be inserted in liquid nitrogen for cooling
Dewar	Nalgene	4150-4000
Liquid nitrogen	Air Liquide	n/a
Nitrogen gas	Air Liquide	n/a
Nitrogen evaporator	Organomation Associates	N-EVAP 111	Can be replaced by homebuilt device
Mortar	Sigma-Aldrich	Z247472
Pestle	Sigma-Aldrich	Z247510
Tissue homogenizer	Kinematica	Polytron	With test tubes fitting homogenizer shaft
Electronic scale	Sartorius	n/a
Methanol	Sigma-Aldrich	M3641
Chloroform	Sigma-Aldrich	366910
Glass centrifuge tubes	Kimble	45500-15, 45500-30	Kimax 15-mL, 30-mL tube
Microcentrifuge tubes	Kimble	45150-2	Kimax 2-mL tube; should replace "Eppen-dorf" tube if compatible with centrifuge rotor
polystyrene pipettes	Costar Corning	Stripettes	5 and 10-mL volumes
Deuterochloroform	Sigma-Aldrich	431915	99.96 % deuterated
Deuterium oxide	Sigma-Aldrich	423459	99.96 % deuterated
Deuterium chloride	Alpha Aesar	42406	20 % in deuterium oxide
Sodium deuteroxide	Sigma-Aldrich	164488	30 % in deuterium oxide
Lyophilizer	Christ	Alpha 1-2
Cold centrifuge	Heraeus	Megafuge 16R
pH meter	Eutech Cybernetics	Cyberscan
CDTA	Sigma-Aldrich	D0922
Cesium hydroxide	Sigma-Aldrich	516988
NMR tubes	Wilmad	528-PP
NMR stem coaxial insert	Sigma-Aldrich	Z278513	By Wilmad
NMR pipettes	Sigma-Aldrich	Z255688
Pipettes	Eppendorf	연구	With tips for volumes from 0.5 to 1000 μL
Pipet-Aid	Drummond	XP
NMR spectrometer	Bruker	AVANCE 400	including probe and other accessories
NMR software	Bruker	TopSpin 1.3	newer version available: Topspin 3.2
Water-soluble standard compounds	Sigma-Aldrich	various
Phospholipid standard compounds	Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich	various various various	Source for plasmalogens, but may be < 70 – 80 % purity
Methylenediphosphonate	Sigma-Aldrich	M9508
TSP-d4	Sigma-Aldrich	269913