Histological और कार्यात्मक विशेषताओं: Methylnitrosourea (MNU) रेटिना अध: पतन और उत्थान zebrafish में -induced
Summary
इस के साथ साथ हम रेटिना डे और उत्थान और वयस्क zebrafish में एन -methyl- एन -nitrosourea का उपयोग दृश्य समारोह पर इसके प्रभाव की मात्रा का ठहराव प्रदर्शित करता है. दृश्य तीक्ष्णता की हानि और कमी हुई फोटोरिसेप्टर संख्या भीतर परमाणु परत में प्रसार द्वारा पीछा किया गया था. पूरा रूपात्मक और कार्यात्मक उत्थान 30 दिनों के प्रारंभिक उपचार के बाद हुई.
Abstract
औद्योगिक दुनिया में दृष्टि हानि के बहुमत के लिए फोटोरिसेप्टर नुकसान खाते परिणामस्वरूप के साथ रेटिना अपक्षयी रोग, जैसे रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा,. पशु मॉडलों जैसे रोगों का अध्ययन करने के लिए निर्णायक महत्व के हैं. इस संबंध में एन -methyl- एन -nitrosourea (MNU) व्यापक रूप से कृन्तकों में इस्तेमाल किया गया है फोटोरिसेप्टर विशिष्ट विष औषधीय रेटिना अध: पतन के लिए प्रेरित करने के लिए. इससे पहले, हम zebrafish में एक MNU प्रेरित रेटिना अध: पतन मॉडल, दृश्य अनुसंधान में एक और लोकप्रिय मॉडल प्रणाली की स्थापना की है.
स्तनधारियों के लिए एक आकर्षक अंतर वयस्क zebrafish रेटिना और नुकसान के बाद अपने उत्थान में लगातार न्यूरोजेनेसिस है. हम वयस्क zebrafish में दृश्य तीक्ष्णता माप कार्यरत है इस अवलोकन यों. इस प्रकार, optokinetic पलटा गैर anesthetized मछली में कार्यात्मक परिवर्तन का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. इस immunohistochemical staini के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ऊतक विज्ञान के साथ पूरक किया गया थाapoptosis के लिए एनजी (TUNEL) और प्रसार (PCNA) के विकास morphological परिवर्तन सहसंबंधी.
संक्षेप में, photoreceptors के apoptosis तीन दिनों बाहरी परमाणु परत (ONL) में कोशिकाओं का एक उल्लेखनीय कमी के बाद है जो MNU उपचार के बाद होता है. इसके बाद भीतर परमाणु परत (लीग) और ONL में कोशिकाओं के प्रसार को मनाया जाता है. इस के साथ साथ, हम एक पूर्ण ऊतकीय लेकिन न केवल भी एक कार्यात्मक उत्थान 30 दिन का समय कोर्स पर होता है कि पता चलता है. अब हम यों और एक वीडियो प्रारूप में MNU का उपयोग zebrafish रेटिना डे और उत्थान पालन करने के लिए तरीकों को वर्णन.
Introduction
विजन इंसान के लिए सबसे आवश्यक भावना है और इसकी हानि एक उच्च सामाजिक आर्थिक प्रभाव पड़ता है. विकसित दुनिया में, रेटिना अपक्षयी रोगों पुराने वयस्कों 1 के बीच दृष्टि हानि और अंधापन का प्रमुख कारण हैं. सबसे अपक्षयी रेटिना रोगों का कारण केवल आंशिक रूप से समझा जाता है और therapeutical समाधान खो दृष्टि हासिल करने के लिए बहुत सीमित हैं. रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा एन -nitrosourea (MNU) रेटिना अध: पतन लाती -methyl- प्राथमिक फोटोरिसेप्टर नुकसान 2-3. एन के साथ एक रेटिना अपक्षयी रोग का एक विशिष्ट उदाहरण है और इसलिए व्यापक रूप से प्राथमिक फोटोरिसेप्टर कोशिका मृत्यु 4 के साथ रोगों मॉडल के कृन्तकों में प्रयोग किया जाता है. यह एक क्षारीकरण एजेंट है और आमतौर पर जोखिम 5-7 के बाद कई महीनों प्रकट जो सौम्य और घातक ट्यूमर की ओर जाता है. इसके अलावा, यह एक अल्पकालिक प्रेक्षण अवधि के भीतर विशिष्ट फोटोरिसेप्टर कोशिका मृत्यु का कारण बनता है. इस प्रकार, रेटिना परत structu का नुकसानफिर से और महत्वपूर्ण रेटिना thinning एक एकाग्रता पर निर्भर ढंग से मनाया गया. रेटिना glia कोशिकाओं को सक्रिय कर रहे थे, लेकिन रेटिना वर्णक उपकला (RPE) में कोई बदलाव नहीं पाया गया. Endoplasmic जालिका (ईआर) तनाव संबंधी apoptosis रेटिना 8 में MNU कार्रवाई का मुख्य मार्ग होने के लिए प्रकट होता है.
हमने हाल ही में zebrafish 9 में फोटोरिसेप्टर अध: पतन के लिए प्रेरित करने के लिए एक रासायनिक मॉडल के रूप में MNU शुरू की है. अन्य कारणों के बीच, zebrafish (Danio rerio) क्योंकि अन्य रीढ़ 10 की है कि अपने दृश्य प्रणाली की समानता का दृश्य अनुसंधान में महत्वपूर्ण बन गया है. बाहरी रेटिना पराबैंगनी, लघु, मध्यम में शिखर संवेदनशीलता, और दिखाई स्पेक्ट्रा की लंबी तरंगदैर्ध्य और एक रॉड फोटोरिसेप्टर प्रकार के साथ चार अलग शंकु प्रकार में वर्गीकृत किया जा सकता है जो फोटोरिसेप्टर, शामिल हैं. भीतर परमाणु परत (लीग) में, द्विध्रुवी, क्षैतिज, और amacrine interneurons की सेल शरीर wel के रूप में पाए जाते हैंमुलर glia कोशिकाओं की कोशिका सोमा के रूप में एल. बाहरी उलझन परत (OPL) में फोटोरिसेप्टर और भीतरी रेटिना के बीच synaptic संपर्क लेंस के लिए निकटतम सेल परत जबकि ऑप्टिक तंत्रिका और ऑप्टिक पथ जिसमें लंबे axons फार्म जो घटकों नाड़ीग्रन्थि सेल परत (जीसी), है, का गठन कर रहे हैं . नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं और भीतर परमाणु परत में कोशिकाओं के बीच synaptic संपर्कों भीतरी उलझन परत (आईपीएल) के 11 में बनते हैं. RPE neurosensory रेटिना के बाहर स्थित है और लंबे समय तक शिखर माइक्रोविली 12 फोटोरिसेप्टर बाहरी क्षेत्रों के चारों ओर. इसके अलावा, zebrafish अत्यधिक पुनर्योजी और lesioned मस्तिष्क, रेटिना, रीढ़ की हड्डी, हृदय, और अन्य ऊतकों 13 regrow करने में सक्षम है. रेटिना क्षति होती है, तो मुलर कोशिकाओं माना जाता है, जो लीग में कोशिकाओं, सक्रिय और विभिन्न रेटिना सेल प्रकार में अंतर करने की क्षमता है कर रहे हैं. इसके अलावा, वे भी ONL में स्थित हैं जो रॉड progenitors, उत्पन्न करते हैं. एक और तोनई कोशिकाओं के साथ वयस्क zebrafish के रेटिना कि आपूर्ति urce सिलिअरी सीमांत क्षेत्र है. इस स्रोत लगातार बढ़ zebrafish आँख 14 में रॉड photoreceptors के एक निरंतर घनत्व प्राप्त करने की आवश्यकता है.
MNU मॉडल रेटिना ऊतक के लिए एक सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य अध: पतन / उत्थान दृष्टिकोण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. कारण zebrafish में जैविक प्रक्रियाओं के कुछ समानता के लिए और मानव में इस शामिल कोशिका मृत्यु रास्ते की पहचान करने के लिए दरवाजे खोल सकता है और संभावित न्यूरोप्रोटेक्टिव दवाओं स्क्रीन करने के लिए. हमारे समूह से पिछले एक अध्ययन के आधार पर हमने अब रेटिना डे और प्रयोगशाला वीडियो 9 अनुसार साथ कार्यात्मक परिवर्तन सहित फलस्वरूप उत्थान के इस MNU प्रेरित zebrafish मॉडल के तरीकों को वर्णन.
Protocol
Representative Results
Discussion
इससे पहले, हमारे समूह zebrafish प्रणाली 9 में कृन्तकों से फोटोरिसेप्टर अध: पतन की MNU मॉडल स्थानांतरित कर दिया है. आगामी घटनाओं का वर्णन किया है और 30 दिनों के लिए पीछा किया गया था. इस समय अवधि में पूरा रेटिना र?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Monika Kilchenmann, Federica Bisignani and Agathe Duda for their excellent technical assistance.
Materials
| Acetic acid | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A6283 | |
| Ammonia | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 294993 | 0.80% |
| Bovine serum albumine (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 05470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
| DAPI mounting medium | Vector Labs, Burlingame, CA, USA | H-1200 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 45260 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2860 | 100%, 96%, 70% |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | ED | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | E10521 | Tricaine |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 3989 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 594 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11012 | |
| Goat normal serum | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 320331 | 0.20% |
| In situ Cell Death Detection Kit | Roche Applied Sciences, Rotkreuz, Switzerland | 11684795910 | TUNEL Kit |
| Mayer's hemalum solution | Merck, Darmstadt, Germany | 109249 | |
| Methylnitrosourea (MNU) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | N4766 | Toxic |
| OptoMotry | CerebralMechanics, Lethbridge, AB, Canada | n.a. | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Proteinase K | Dako, Glostrup, Danmark | S3004 | |
| Rabbit anti-PCNA | Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA | sc-33756 | |
| Superfrost Plus glass slides | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany | 10149870 | |
| Tris buffered saline (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5912 | |
| TrizmaÒ base | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | T1503 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P1379 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 534056 | |
| Zebrafish (Danio rerio) AB (Oregon) strain | University of Fribourg, Dept. of Biology | n.a. | Own fish facility |
References
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